[发明专利]一种组织来源外泌体的提取方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说，是一种组织来源外泌体的提取方法及应用。

背景技术

外泌体(exosome)是由多种活细胞分泌的囊泡小体，直径50-150nm，是多泡体膜与细胞膜的融合后产生的，其中含有蛋白质和RNA等多种组分。随后的研究发现，外泌体能携带RNA进行细胞间物质的交换，并可在受体细胞内发挥生物学功能，这意味着外泌体是细胞之间遗传物质交流的新途径，开拓了遗传学上的新机制。最新研究表明，外泌体与癌症的转移有关联，癌症细胞通过外泌体运载蛋白、RNA等大分子在远端为其营造适合其生存的微环境。肿瘤外泌体可直接或间接影响肿瘤微环境中的血管生成因子，帮助内皮细胞生长，促进血管生成。几乎所有的体液中都存在外泌体，例如脑髓液、唾沫、母乳等，在母乳中的外泌体对婴儿的发育有积极的作用；在诊断方面，通过分析癌症病人和正常病人的外泌体中物质的差异，可筛选出了具有高敏感性的特异性标志物，对于疾病的诊断有重要意义。

1983年，外泌体首次在绵羊网织红细胞中被发现，由于外泌体的发现比较晚，学者对外泌体的许多研究还处于初始阶段，人们对它了解甚少；因此，外泌体的许多特性和功能有待研究和发掘，而研究外泌体的前提是如何提取和纯化外泌体。目前外泌体的提取方法主要可归纳为以下六种：一是超速离心法；二是过滤离心；三是密度梯度离心法；四是免疫磁珠法；五是PS亲和法；六是色谱法。这些方法被应用于体液、血清、唾液、细胞上清等不同标本类型外泌体的提取。

目前许多研究者使用体液或细胞培养上清作为提取外泌体的原材料，多采用超高速离心的方法获取外泌体。而对于组织样本，是研究外泌体的重要领域，但由于获取外泌体的难度较大，仅有极少数人选用组织样本作为研究外泌体原材料，而他们获取组织来源外泌体的方法还有待商榷，他们将组织破碎成细胞悬液后进行培养，收获上清进行外泌体提取，此方法加入了培养环节，增加了人为干扰因素；且组织细胞培养的外环境与组织所在的内环境有很大差异，可能会导致产生的外泌体也不同，因此该方法收集的外泌体并非我们研究的理想标本。

中国专利文献CN106222126A公开了一种人体体液中外泌体的提取方法。中国专利文献CN106124282A公开了一种叠层离心过滤分离提取外泌体的方法。中国专利文献CN105675774A公开了一种唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用。中国专利文献CN106289927A公开了一种从肿瘤细胞上清中分离微囊泡及其外泌体的方法。但是关于如何处理组织样本、使用何种方法提取组织外泌体的方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种组织来源外泌体的提取方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种组织来源外泌体的提取方法，所述的方法基于酶裂解组织后直接进行外泌体提取，所述的方法包括以下步骤：

步骤一、将组织用机械法剪碎后加入胶原酶和Dnase酶进行裂解；

步骤二、对裂解后的混合液使用PEG法进行外泌体提取操作。

进一步地，步骤一为以下步骤：

(1)新鲜组织直接置于冷的1640培养液中，用机械法将组织破碎；

(2)加入的胶原酶和Dnase酶裂解组织为细胞悬液。

进一步地，步骤一为以下步骤：

(1)冷冻的组织迅速置于37℃水浴锅中回温，之后置于冷的1640培养液中，用机械法将组织破碎；

(2)加入的胶原酶和Dnase酶裂解组织为细胞悬液。

进一步地，步骤二为以下步骤：

(1)将混合液3000g 4℃离心30min后将上清转移到新的离心管，13000g 4℃离心10min取上清；

(2)将上述上清通过过滤膜进行过滤，进一步去除上清液中的细胞残片及其他杂质；

(3)将滤过液与PEG溶液按照1:1比例混合，颠倒混匀，4℃孵育过夜；

(4)第二天13000g 4℃离心30min，弃上清；留沉淀再次13000g 4℃离心5min，小心吸走残余上清，沉淀即为外泌体。

进一步地，所述胶原酶为0.5mg/ml的IV型胶原酶，Dnase酶为0.2％(w/v)的Dnase I。

进一步地，步骤(2)为：加入的胶原酶和Dnase酶裂解组织为细胞悬液，裂解体系在摇床上孵育90min，每30min用移液枪轻柔吹打1min。

进一步地，所述过滤膜孔径为0.22μm的混合纤维素滤膜。

进一步地，所述的PEG溶液为16％(w/v)PEG6000溶液。