[发明专利]一种生物土壤固化剂的制备方法

权利要求书

1.一种生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下步骤：

将预处理的巴氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌分别接种至培养液中，混合均匀，培养，得巴氏芽孢杆菌培养液和枯草芽孢杆菌培养液，将两种培养液分别划线接种至然斜面固体培养基中，培养，出现有乳白色菌落，得到两种菌种斜面培养物；

取上述两种斜面培养物挑取菌落接种于催化酶发酵液中，置光照培养箱培养，得种子培养基，将种子培养基接种至催化酶发酵培养液中，置于振荡器上振荡培养，得催化酶发酵液；

取催化酶发酵液，离心，收集沉淀物A，向沉淀物A中加磷酸缓冲液，破碎处理，间隙处理三次，得处理液，将处理液离心，收集上清液，上清液中加入乙醇，离心，收集沉淀物B，沉淀物B加磷酸缓冲液研磨，离心，弃沉淀，经超滤膜超滤，弃清液，收集截留液，将截留液上CM－纤维素柱，分别用浓度为0.lmol/L和0.2mol/L，pH都为6.8的磷酸缓冲液梯度洗脱，收集酶活力高峰管，将酶活力高峰管装于透析袋，用聚乙二醇脱水浓缩，将浓缩酶液再上DEAE－sephadexA－50层析柱，分别用浓度为0.lmol/L和0.2mol/L，pH都为6.8的磷酸缓冲液梯度洗脱，收集酶活力高峰管，经浓缩后冷冻干燥，得催化酶粉；

取上述催化酶粉，加入石英砂和粘结液，进行固化反应，得生物土壤固化剂。

2.根据权利要求1所述的生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中巴氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的预处理：分别取巴氏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌冻干粉用酒精灯加热安颈瓶上部，然后滴几滴水使之破裂，用镊子取出内管，分别吸取液体培养基注入两种安瓿瓶，使冻干粉溶解，得到预处理的两种菌种。

3.根据权利要求1所述的生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中固体培养基的配方为：按质量份数计，取葡萄糖6~8份，胰蛋白胨 15~20份，酵母提取物5~10份，(NH4)₂HPO₄0.2~0.4份，KH₂PO₄ 0.1~0.4份，MgSO₄•7H₂O 0.04~ 0.1份，NaCl12~ 15份，琼脂10~20份，磷酸缓冲液0.05~0.1份，水1000份，121℃灭菌20min，pH5.6±0.2；液体培养基的配制：除去琼脂成分，其他组分不变，即得。

4.根据权利要求1所述的生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中溶解后的菌种与培养液的质量比为1:6，培养条件为25~33℃培养2~3天。

5.根据权利要求1所述的生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中巴氏芽孢杆菌斜面培养物、枯草芽孢杆菌斜面培养物和催化酶发酵液的质量比为2:1:9；催化酶发酵培养基的配方为按质量份数计，蛋白胨0.5~0.8份，葡萄糖10~12份，KH₂PO₄ 0.05~0.1份，Na₂HPO₄2~5份，MgSO₄•7H₂O 0.02~0.05份，尿素5~10份，pH7.0±0.2，尿素在紫外灯下灭菌30min后混合。

6.根据权利要求1所述的生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中种子培养基的接种量为质量分数为2%，培养条件为30~35℃培养72h。

7.根据权利要求1所述的生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中沉淀物与缓冲液的质量比为2:1，上清液与乙醇的质量比为2:7。

8.根据权利要求1所述的生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中石英砂的预处理：选用标准石英砂（含99.7%石英），先用浓度为0.1mol/L的NaOH 溶液浸泡，清洗，再用浓度为0.1mol/L的HCl溶液浸泡，清洗，最后再用去离子水清洗，烘干即得。

9.根据权利要求1所述的生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中粘结液的配方为尿素、CaCl₂、NH₄Cl、NaHCO₃、Nutrient Broth按质量比3:7:1:1:1混合均匀即得。

10.根据权利要求1所述的生物土壤固化剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（4）中催化酶粉、石英砂、粘结液的质量比为3:5:7，固化反应7~8天。