[发明专利]非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料及其制备方法

说明书

本发明提供非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料及其制备方法，非病毒载体带正电，MicroRNA带负电，MicroRNA与非病毒载体以静电作用的方式相结合，通过混合静置的方式形成MicroRNA非病毒载体复合体，MicroRNA非病毒载体复合体再与骨粉进行混合，得到非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料。本发明的有益效果是填补了临床上单独使用骨粉带来的缺陷，赋予骨粉骨生成性和诱导性，既可提高牙槽骨的成骨质量，又可缩短成骨时间。

技术领域

本发明涉及生物医用组织工程材料技术领域，更具体地说涉及一种基于非病毒类载体投递microRNA并掺杂已经商用的骨粉促进牙槽骨快速愈合的方法。

背景技术

针对牙列缺失或缺损，目前医学上多采用可摘义齿、烤瓷牙技术或牙齿种植术对牙列进行填补修复。可摘义齿适用范围广，便于自行摘戴，且费用相对较低，但稳定性较差，长期使用可能会造成基牙损伤，引发一系列口腔疾病；烤瓷牙美观坚固、耐磨抗折且生物相容性较好，但因其以邻近齿为受力依托，长时间使用会造成周边牙齿松动，故而口腔种植技术逐渐受到人们关注。但是有很大一部分患者因为牙槽骨骨量不足而不能及时甚至无法进行口腔种植。

目前，临床上解决骨量不足的治疗手段主要有自体骨、同种异体骨、异种骨、人工骨替代材料或组织工程骨植入等。其中，自体骨移植作为传统的治疗手段，最大优势即不会产生免疫排斥反应，但因供体骨量有限，大量取材较为困难，且易造成二次创伤，高吸收、并发症较多。同种异体骨和异种骨移植手段我们需解决外源性抗原问题，尽量避免免疫排斥反应，降低二次疾病的风险。经查阅，骨粉有着与人体骨相似的钙磷比例，具有较为适宜的孔连接内径，有利于细胞的渗透与营养物的循环。因其具有的较高孔隙率和相互连通性，可促进位于腔隙中成骨细胞之间的胞间通讯，故而被视为骨传导的良好材料。但是骨粉作为无机支架材料，缺乏诱导成骨的活性因子，所以骨粉虽然具有优异的骨传导性但没有骨诱导和骨生成性。

MicroRNA又称微小RNA，长度约为22个核苷酸，通过碱基配对方式结合到靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)，可以抑制其翻译，但不影响其转录。大量研究证实，miRNA在干细胞向成骨细胞分化和骨形成中扮演着重要的角色。但是MicroRNA在体内容易被酶降解，且本身含有磷酸根基团带负电性而不能主动进入细胞，进而难以发挥诱导成骨的作用。为使目的基因发挥其最大效用，我们需要选择合适的载体来进行投递。骨组织工程常用载体有两种：病毒载体及非病毒载体。

非病毒载体包括脂质体、阳离子聚合物、无机纳米粒子投递系统等。投递microRNA的载体进入机体后，首先要通过排列较为致密的细胞外基质及各种纤维蛋白，该过程往往会阻碍载体向细胞内的递送，致使效率降低；到达靶细胞后，细胞以内吞的方式将非病毒载体转运至细胞内部，该过程需保持递送载体的活性，同时使其在胞内进行降解。非病毒载体安全性高，可设计性及可操作性强，对其进行修饰改造较易满足以上要求。脂质体是一种类脂类双分子层的球状囊泡结构，以脂类为主要成分，具有一定的生物可降解性及较好的生物相容性。脂质体用作基因载体有着二十余年的历史，最早使用脂质体递送RNA的是Felgner等人。他们开发了一种较为有效的RNA转染方法，使用合成的阳离子脂质——DOTMA与脂质体相混合，将带有荧光素酶的mRNA在体外转染进NIH 3T3小鼠细胞中，观察荧光素酶在细胞中的表达情况。实验结果证实了该种方法可将RNA有效的转染进生物细胞中，且组织学检测结果表明基因在细胞中得到了较好的表达，转染进NIH 3T3小鼠细胞后，加盖B8-球蛋白非翻译序列产生了多于对照组至少1000倍的荧光蛋白。无机纳米粒子投递系统包括金纳米粒子、介孔硅纳米粒子等。金纳米粒子具有生物惰性，毒性较低，易于进行修饰、合成和功能化。

发明内容

本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料及其制备方法，以骨粉作为支架材料，保持了多孔的天然骨无机结构，有着与人牙槽骨相似的物化结构和力学性能，且生物相容性较好，引入脂质体等非病毒载体包载的microRNA，将活性因子引入支架材料中，发挥骨诱导的作用，以填补单独使用骨粉带来的缺陷。