[发明专利]一种动物心脏单细胞悬液的制备及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种心脏细胞悬液的制备方法，具体涉及一种动物心脏单细胞悬液的制备及检测方法。

背景技术

小鼠动物模型实验是进行科学研究的重要方法，与大鼠等动物模型相比，在炎症免疫方面的实验中小鼠来源的炎症细胞分类、细胞标记、实验相关抗体等更加详尽、充沛。炎症细胞的研究不仅需要定性及形态学的研究，定量及功能研究可以提供更为准确、全面的信息。

小鼠心脏缺血损伤动物模型中病变呈局灶性分布，病理切片易受到取材误差干扰及观察视野影响。

随着心脏疾病研究的不断发展，心脏离体实验已越来越被人们所重视，尤其是具备正常生理功能的单个心肌细胞已成为研究心脏代谢、功能、病理生理机制的重要基础。如果直接制备心脏单个细胞悬液后进行流式细胞检测，不仅可以定量，还可以应用多抗体标记从而更为详细地区分细胞亚群。

在肝脏、脾脏等血窦丰富、胶原纤维少的器官，制备单细胞悬液较为容易，对脏器进行研磨即可，而在心脏这一肌性器官，富含胶原纤维，如何制备心脏单细胞悬液且对细胞活性影响最小，还缺乏系统、详尽的报道。

目前，对细胞群的检测的方法为：将单细胞悬液通过Ficoll分层液法或Percoll分层液法富集白细胞后进行FACS分析目的细胞，研究目的细胞在白细胞中的相对变化，该方法操作复杂，且缺乏与心肌细胞总数的对比，无法提供更为全面的数据。

发明内容

本发明的目的是提供一种动物心脏单细胞悬液的制备及检测方法，该方法解决了现有技术未提供具体的心脏单细胞悬液制备方法，以及检测方法操作复杂的问题，能够稳定、可靠的制备心脏单细胞悬液，并且检测方法简单，能够全面分析心脏单细胞悬液中的细胞亚群（具有不同细胞抗原的细胞群体）。

为了达到上述目的，本发明提供了一种动物心脏单细胞悬液的制备方法，该方法包含：

步骤1：制作动物心脏缺血再灌注模型；

步骤2：取动物离体心脏组织，冲洗去除血液，加入心脏消化液，剪碎，混匀消化；

步骤3：过滤步骤2得到的混合溶液，离心，去除上清液，终止消化，加入磷酸盐缓冲液悬浮，加入红细胞裂解液，离心，去除上清液，加入磷酸盐缓冲液悬浮，得到动物心脏单细胞悬液。

在步骤2中，所述的心脏消化液包含：RPMI-1640培养基，Collagenase I和DNase；所述的心脏消化液的质量：动物离体心脏组织的体积为1.8~2.2g：11mL。

在步骤2中，所述的RPMI-1640培养基的体积：Collagenase I的质量：DNase的质量=1mL：1.6mg：0.2mg。

在步骤2中，所述的动物心脏组织采用磷酸盐缓冲液冲洗以去除血液。

在步骤2中，所述的消化在室温条件下进行，消化60min并间断混匀。

在步骤3中，所述的过滤采用140目的滤网。

在步骤3中，所述的离心的速度为1000~1200rpm，第一次离心的时间为10min，第二次离心的时间为5min。

在步骤3中，所述的混合溶液中加入的磷酸盐缓冲液与红细胞裂解液（购自BD公司，型号：349202，规格100mL）的体积比为1：10。红细胞裂解液用于去除红细胞又不破坏心脏细胞。

所述的动物为小鼠。

本发明还提供了一种动物心脏单细胞悬液的检测方法，该检测方法检测的动物心脏单细胞悬液通过如所述的动物心脏单细胞悬液的制备方法获得，该检测方法包含：

取动物心脏单细胞悬液，加入CD45、CD11c和Ly6C的抗体或同型对照，标记所述的动物心脏单细胞悬液中的白细胞，以及树突状细胞和单核细胞，磷酸盐缓冲液冲洗，避光，流式细胞检测；选取所述的CD45的抗体或同型对照标记的白细胞，再分析CD45阳性细胞中被标记了CD11c，Ly6C的细胞亚群。

本发明的动物心脏单细胞悬液的制备及检测方法，解决了现有技术未提供具体的心脏单细胞悬液制备方法，以及检测方法操作复杂的问题，具有以下优点：

（1）本发明的心脏消化液未使用胰蛋白酶，以减少对细胞的破坏作用；

（2）本发明的心脏消化液中除了胶原酶I以外，加入DNase以减少细胞凝集；

（3）本发明的心脏消化液能够稳定、可靠地消化细胞，且得到的细胞含量较高，细胞数约为1×10⁶~2×10⁶个；