[发明专利]针对淀粉酶BLA的启动子文库及强启动子

说明书

本发明涉及一种启动子文库，用于在枯草芽胞杆菌中高效表达淀粉酶BLA，所述文库的探针载体为整合型载体，以避免质粒拷贝数对文库表征的影响，在BLA表达框上下游均有强转录终止子，避免上下游遗传元件对BLA表达的影响，所述文库的构建方法包括寡核苷酸退火，IIs型限制性酶和连接酶同时酶切/酶连。为了提高探针载体整合效率及降低内源性淀粉酶AmyE的背景，在启动子文库转化枯草芽孢杆菌时，使用CRISPR/cas9系统在整合位点处引入DNA双链断裂。转化后涂布于底物平板，对水解圈大的转化子通过96孔板复筛，复筛后较强的转化子再通过摇瓶进一步复筛。经由上述步骤，得到比P43表达BLA更高效的启动子22个，其中7个杂合启动子的强度高于所有出发启动子。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种针对目的基因的启动子文库及其构建方法以及获得的强启动子。

背景技术

α-淀粉酶是应用最早、应用范围最广、需求最大的工业酶制剂之一，在国内外酶制剂市场上占有重要地位。地衣芽孢杆菌(Bacillus lincheniformis)来源的α-淀粉酶BLA属于耐高温淀粉酶，最适温度在90℃左右，应用于淀粉液化等工业中，及用于纺织退浆、洗涤等行业。

枯草芽孢杆菌属于革兰氏阳性、杆状土壤细菌。枯草芽孢杆菌具有很强的分泌能力，能将外源蛋白直接分泌到培养基中，不仅有效避免蛋白形成包涵体，且能够极大简化后续纯化步骤，降低生产成本。枯草芽孢杆菌不产脂多糖等内毒素，属于GRAS菌株，可用于生产食品、医药等相关蛋白及代谢产物。此外，目前已有很成熟的枯草芽孢杆菌遗传操作手段和大规模发酵技术。由于上述优点，枯草杆菌已成为最常用的工业酶表达宿主之一，由枯草芽孢杆菌生产的酶蛋白约占整个酶制剂市场份额的60％左右。因此，提高外源蛋白在枯草芽孢杆菌中的表达量，是进一步开发枯草芽孢杆菌细胞工厂，拓展枯草芽孢杆菌应用范围的关键问题。

目前有多种策略可用于提高外源蛋白的表达量，基因水平、转录水平、翻译水平及翻译后修饰等都可作为改造的靶点，如提高基因拷贝数、核糖体工程、密码子优化等。对于原核生物来说，筛选强启动子以提高目的基因转录本数量，是最简单、有效的方式。检索现有技术发现，已有在大肠杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母等构建启动子文库筛选高效启动子的报道，但还没有直接在枯草杆菌中构建启动子文库的文献报道。申请人前期研究中构建了以GFP为报告基因的启动子文库，然而我们将筛选到的启动子用于表达目的基因时，基因的表达量很低，且表达量与启动子强度不成比例，暗示启动子具有一定的基因特异性，即以A基因为报告基因筛选到的强启动子用于表达B基因时，往往很难保证高效的表达量。因此，要使目的基因过表达，需要针对目的基因构建一个特定的启动子文库，继而从中筛选到高表达目的基因的启动子序列。

发明内容

为了实现α-淀粉酶BLA在枯草芽孢杆菌中的高效表达，本发明通过在枯草芽孢杆菌中构建针对BLA的特定启动子文库，筛选能高效表达BLA的强启动子。因此，本发明的目的在于提供一种针对α-淀粉酶BLA的启动子文库及其构建方法和应用。

为了实现本发明的目的，发明人创造性地采用寡核苷酸退火和金门克隆方法，通过出发启动子间的随机组合，获得BLA基因的组合启动子文库，并筛选到比P43启动子更有效地表达BLA的启动子序列。

在本发明的第一个方面，提供一种针对淀粉酶BLA的启动子文库，所述的启动子文库包括SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ ID NO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ IDNO.48和SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的启动子。

需要说明的是，本发明中所述的“启动子”是指一段能够结合RNA聚合酶的核酸序列，能够将位于其下游的开放阅读框转录为mRNA。

进一步优选地，所述的启动子文库由SEQ ID NO.43、SEQ ID NO.44、SEQ IDNO.45、SEQ ID NO.46、SEQ ID NO.47、SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49所示核苷酸序列的启动子组成。