[发明专利]非B亚型GAG蛋白在慢病毒包装中的应用

说明书

背景技术

重组疫苗已随重组DNA技术的进步而发展，重组DNA技术能够修饰病毒基因组以产生修饰的病毒。通过这种方式，已能够将遗传序列引入非致病性病毒，从而它们编码需要在干扰后于靶细胞内得以表达的免疫原性蛋白质，以在其宿主内发展特定免疫应答。

此类疫苗构成了疫苗技术中的重大进步(Kutzler等,Nat Rev Genet,9(10):776-788,2008)。具体而言，它们具有优于传统疫苗的优势：避免活(减毒的)病毒和消除灭活疫苗制造的相关风险。

采用经修饰的逆转录病毒(逆转录病毒载体)的基因递送在上世纪80年代早期由Mann等描述(Cell,33(1):153-9,1983)。最常用的致瘤性逆转录病毒基于莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MLV)。其基因组简单，从该基因组产生多聚蛋白质Gag、Pol和Env，并以反式形式供病毒复制所需(Breckpot等,2007,Gene Ther,14(11):847-62；He等，2007,Expert Rev vaccines,6(6):913-24)。一般需要的顺式序列是长末端重复序列(LTR)及其如下周边序列：整合所需的反向重复序列(IR或att位点)、包装序列Ψ、转运RNA结合位点(引物结合位点，PBS)，和逆转录涉及的一些其它序列(LTR内的重复R，以及多嘌呤序列(PPT)，正链起始所必需)。为了生成复制缺陷型逆转录病毒载体，通常使gag、pol和env基因全部缺失，并且用表达盒替代。

源自慢病毒基因组的逆转录病毒载体(即，慢病毒载体)已涌现为用于基因治疗和免疫治疗目的的有希望的工具，因为它们显示优于其它病毒系统的若干优势。具体而言，慢病毒载体本身无毒，并且不像其它逆转录病毒，慢病毒能够转导非分裂细胞，尤其是树突细胞(He等，2007,Expert Rev vaccines,6(6):913-24)，这允许通过内源性通路的抗原递呈。慢病毒代表逆转录病毒科(Retroviridae)的一个慢病毒(slow virus)属，其包括人免疫缺陷病毒(HIV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性脑炎病毒(EIAV)、山羊关节炎脑炎病毒(CAEV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猫免疫缺陷病毒(FIV)。慢病毒可以无限地持续存在于其宿主内，并且在一生的感染期间以不同速度连续复制。所述病毒在其宿主内的持续复制取决于其避开宿主防御的能力。

重组慢病毒载体的设计基于所述慢病毒的顺式与反式作用序列的分离。非分裂细胞中的有效整合与复制需要所述慢病毒基因组中存在两种顺式作用序列：中心多嘌呤序列(cPPT)和中心终止序列(CTS)。它们导致形成三链DNA结构，称为中心DNA“瓣(flap)”，该结构使基因进入非分裂细胞(包括树突细胞(DC))核内的效率最大化(Zennou等,2000,Cell,101(2)173-85；Arhel等,2007,EMBO J,26(12):3025-37)。

已经基于由包装构建体为反式包装载体提供B亚型Gag、Pol、Tat和Rev蛋白而生成了HIV-1慢病毒载体(Naldini等,PNAS 15:11382-8(1996)；Zufferey等,Nature Biotechnology 15:871-875,1997)；Dull等,Journal of Virology(1997))。这些研究采用B亚型Gag和Pol蛋白进行。而HIV-1包装构建体中非B亚型gag和pol序列的作用还未经评估。

除B亚型外存在HIV-1的多种不同亚型。HIV-1的一些亚型，例如C、E和A亚型，似乎在转送上比HIV-1B亚型(美国和欧洲的主要亚型)更为有效。Essex等,Adv Virus Res.1999；53:71-88。在发达西方国家，发现HIV-1优势亚型是进化枝B，这与存在于非洲和亚洲(绝大多数HIV感染人类的居住地)的那些亚型和重组子相差甚远。Spira等,J.Antimicrobial Chemotherapy(2003)51,229-240。因此，在北美和欧洲所见的B亚型逆转录病毒与全球范围人类传染的那些病毒亚型之间可能存在严重差异(出处同上)。亚型差异可影响HIV传播模式。同性传播和静脉内药物滥用是在欧洲和美国观察到的进化枝B株系的主要传播模式(出处同上)。相反，进化枝A、C、D和E在非洲和亚洲占优势，在这些地方异性传播为主(出处同上)。此外，一些研究提出艾滋病(AIDS)的进展视感染性亚型而有不同(出处同上)。因此，似乎HIV-1B亚型与其它HIV-1亚型差异很大。