[发明专利]重组高温裂解酶的快速纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组高温裂解酶的快速纯化方法。

背景技术

蛋白纯化是生物酶提取中的重要步骤，通常纯化的方法有亲和层析、分子筛、有机溶剂分级分离法、等电点沉淀法等，以上方法涉及的步骤根据蛋白的特性繁简不一，很多时候要通过多种方法的组合才能获得目的蛋白，同时纯化的步骤越多，蛋白的回收效率将受到重大影响，可见提高蛋白的提取效率始终是蛋白质提取中的核心问题，在工业应用中，蛋白的提取工艺甚至会对产品的质量和成本造成重大影响。

大肠杆菌是目前重组蛋白表达的最重要的宿主菌株，在研究和工业生产中被广泛利用。为了将表达的目的蛋白从大肠杆菌中释放出来，常用的方法有超声破碎、高压匀浆、冻融等方法，鉴于许多表达的目的蛋白为热不稳定蛋白，在进行以上操作的时候经常要在低温下进行，而且受到破碎菌体总体积的影响，操作的便利性受到一定的限制。

发明内容

本发明目的在于提供一种重组高温裂解酶的快速纯化方法，该方法利用大肠杆菌作为重组高温裂解酶的表达宿主，通过加热使大肠杆菌破裂进而释放出已表达的高温裂解酶，变性沉淀大肠杆菌蛋白，再通过超滤进行细菌碎片截流和裂解酶蛋白浓缩，快速获得较高纯度的高温裂解酶的方法。

本发明方法具体操作如下：利用大肠杆菌作为重组高温裂解酶的表达宿主，重组高温裂解酶在大肠杆菌宿主细胞中经诱导表达后，经过离心收集菌体，菌体用pH为6.5-8.0的磷酸缓冲液将离心沉淀的菌体重新悬浮起来，于60-80℃热处理10-40min，以达裂解大肠杆菌的目的，获得菌体破碎液；利用0.1-0.45μm的滤膜对破碎液进行超滤，截留大肠杆菌细胞碎片和变性蛋白沉淀，收集滤过液获得裂解酶粗酶液；根据裂解酶的分子量大小，以3K-100K道尔顿的超滤膜包对裂解酶粗酶液进行截留浓缩，从超滤的浓缩液中获得所需的高温裂解酶，实现对重组高温裂解酶的纯化和浓缩。

高温酶最重要的特征在于其在高温下能保持很好的热稳定性和活性，在常温下稳定性高，易于保存；在进行高温酶的分离纯化中可以充分利用其区别于常温蛋白的热稳定性进行分离纯化，大肠杆菌在55℃以上孵育15分钟即可导致其细胞破裂，进一步使其蛋白热变性沉淀，而利用大肠杆菌表达的高温酶因其热稳定在热裂解大肠杆菌时不会受到破坏，热裂解还造成大肠杆菌热不稳定蛋白的大量失活沉淀，在一定程度上提高了高温酶的比活，去除了大量的杂蛋白，这对高温酶的纯化是非常有利的，可见利用大肠杆菌表达高温酶结合热裂解破碎沉淀杂蛋白，结合超滤进行蛋白质的过滤和浓缩，将成为重组高温酶纯化的快速方法。

本发明的有益效果：

本发明充分利用常见的蛋白表达菌株为常温菌大肠杆菌，其菌株和菌体蛋白均在高温下不稳定，而高温酶具有热稳定性的特征，通过热裂解结合超滤浓缩将有利于快速纯化浓缩目的高温酶，在热裂解时，释放的裂解酶也会发挥其裂解功能，参与到细菌的裂解过程，加快细菌的裂解；这种方法操作简单，大肠杆菌蛋白热变性去除率高，纯化浓缩效率高，结合其他纯化方法，将有利于获得更高纯度的高温酶，此种方法易于工业生产放大，为重组高温酶的纯化提供了新的方法。

附图说明

图1是不同裂解温度下大肠杆菌制备的裂解液的SDS-PAGE电泳图；M为蛋白maker，1泳道是菌体超声破碎裂解液，超声破碎的功率为140W，超声破碎的时间为20min，在冰浴下进行；2泳道是菌体55℃热处理20min裂解液；3泳道是菌体60℃热处理20min裂解液；4泳道是菌体65℃热处理20min裂解液；5泳道菌体是70℃热处理20min裂解液；6泳道是菌体75℃热处理20min裂解液；7泳道是菌体80℃热处理20min裂解液；

图2是测试菌株TC16菌体正常形态；

图3是大肠杆菌菌体65℃热处理20min的裂解液对测试菌株TC16菌体裂解效果的显微镜观察结果；

图4是两种裂解液经3KDa通过超滤管浓缩后样品的SDS-PAGE电泳图；M为maker，1泳道是菌体超声破碎裂解液，超声破碎的功率为140W，超声破碎的时间为20min，在冰浴下进行；2泳道是通过菌体65℃热处理20min裂解液；

图5是裂解酶抑菌效果检测结果；1是超声破碎裂解液（蛋白浓度为316μg/mL），2是菌体热裂解后浓缩酶液（蛋白浓度为216μg/mL），3是卡那霉素对照（80μg/mL）。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容。