[发明专利]一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法

说明书

技术领域

本发明属于生命科学领域领域，具体涉及一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法。

背景技术

异柠檬酸裂解酶（ICL）主要存在于植物和微生物中，油料作物种子在萌发过程中，通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物，异柠檬酸裂解酶则是乙醛酸循环的关键酶之一。

异柠檬酸裂解酶催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，可通过测定乙醛酸的变化间接反映异柠檬酸裂解酶活性的高低。目前应用较的异柠檬酸裂解酶活性测定方法是比色法，即乙醛酸和二硝基苯肼作用形成乙醛酸苯肼，在碱性条件下显褐色，颜色的深浅与乙醛酸含量呈正比，以此间接算出异柠檬酸裂解酶的活性。由于丙酮酸也能与二硝基苯肼反应，该方法受到的干扰较大，存在假阳性，科研工作中迫切需要开发一种新的方法来检测异柠檬酸裂解酶活性。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明旨在提供一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒及其方法，可高效准确地测定异柠檬酸裂解酶的活性。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种异柠檬酸裂解酶活性测定试剂盒，包括以下试剂：

提取液，液体100mL×1瓶，由Tris-HCl缓冲溶液、KCl、MnCl₂、DTT和EDTA混合而成，并调pH至7.0，置于100mL容量瓶中，4℃保存；

试剂一，液体15mL×1瓶，由磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液和水混合而成，置于15mL试剂瓶中，4℃保存；

试剂二，粉剂×1瓶，由MgCl₂·6H₂O、DTT和NADH混合而成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；

试剂三，液体360μL×1支，由乳酸脱氢酶组成，置于1.5mL EP管中，4℃保存；

试剂四，粉剂×1瓶，由异柠檬酸组成，置于5mL试剂瓶中，4℃保存。

进一步的，所述提取液中含有的Tris-HCl缓冲溶液的物质的量浓度为100mmol/L ，pH为7.0，体积为100mL，KCl的质量为150mg，MnCl₂的质量为99mg，DTT的质量为31mg，EDTA的质量为3mg。

进一步的，所述试剂一中含有的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液的物质的量浓度为0.1mmol/L，pH为7.0，体积为3.85mL，水的体积为11.15mL。

进一步的，所述试剂二中含有的MgCl₂·6H₂O的质量为20mg，DTT的质量为3mg，NADH的质量为4.5mg。

进一步的，所述试剂三中含有的乳酸脱氢酶的酶浓度为500U/mL，体积为360uL。

进一步的，所述试剂四中含有的异柠檬酸的质量为25.8mg。

一种采用上述试剂盒的异柠檬酸裂解酶活性测定方法，基于微量法，其原理是异柠檬酸裂解酶（ICL）催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸，乙醛酸和NADH在LDH的作用下生成乙醇和NAD，NADH在340nm下有特征吸收峰，监测340nm吸光度的减小速率可间接反应异柠檬酸裂解酶的活性；

该方法的具体步骤如下：

步骤1 仪器和用品的准备；

准备酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水；

步骤2 样本的前处理；

1）对于细菌或培养细胞的前处理，具体操作如下：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；然后按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；最后采用离心率15000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；

2）对于组织的前处理，具体操作如下：

先按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆，然后采用离心率15000g，4℃下离心10min，取上清，置冰上待测；

步骤3将酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零；

步骤4样本测定；

1）工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；