[发明专利]一种快速分离外泌体的方法

说明书

本发明公开一种快速分离外泌体的方法，以超滤的方法对血清进行预处理，以聚乙二醇为间隔合成超顺磁纳米颗粒与配体的复合物，利用配体与外泌体表面的受体的特异性结合，形成基于外泌体的超顺磁性纳米离子团簇，在磁场作用下实现对外泌体的分离。本发明方法可以快速有效的清除血液中的游离配体，增加外泌体表面瞄定的超顺磁纳米颗粒的数目，从而快速的分离血液中的外泌体。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说涉及一种优化的基于超顺磁纳米颗粒簇快速分离血液中外泌体的方法。

背景技术

外泌体是指由哺乳动物细胞分泌到细胞外微环境的一类直径为40～100nm的膜结构囊泡，其可以从多种细胞培养基及动物体液中分离得到。由于其独特的生物来源，丰富的表面膜蛋白和脂质双分子层结构，外泌体已经在药物投递载体领域得到了越来越多的关注{van Dommelen,Susan M.,et al.Microvesicles and exosomes:opportunities forcell-derived membrane vesicles in drug delivery.Journal of ControlledRelease 161.2(2012)；Vader,Pieter,et al.Extracellular vesicles for drugdelivery.Advanced drug delivery reviews 106(2016)}。目前已经利用外泌体投递各种治疗性分子，例如化疗药物，蛋白质，基因等等。虽然这种基于外泌体的药物投递系统已取得了显著的进展，但仍面临很多挑战。首先，目前外泌体的主要来源为细胞培养基，其中的外泌体数量非常有限，并且通常含有致癌或免疫原性成分。其次，外泌体的分离和提纯较困难，一些传统的分离方法，如超速离心，蔗糖密度梯度法等既费时又费力。另外，作为药物投递载体，外泌体必须被赋予肿瘤靶向能力，因为其表面缺乏靶向因子，血液循环半衰期较短{Imai,Takafumi,et al.Macrophage-dependent clearance of systemicallyadministered B16BL6-derived exosomes from the blood circulation in mice.Journal of extracellular vesicles 4.1(2015)}。

健康动物的体液如血液是优选的外泌体来源，因为其具有较高的生物安全性且其中的外泌体数量较多。然而由于血液的成分较复杂，传统的分离方法得不到较纯的外泌体。为了解决这个问题，我们课题组以前开发了一种新的基于超顺磁纳米颗粒簇(SMNCs)分离血液中外泌体的方法。通过这种免疫磁性分离方法，我们同时解决了外泌体的来源、分离和靶向的问题{Qi,Hongzhao,et al.Blood exosomes endowed with magnetic andtargeting properties for cancer therapy.ACS nano 10.3(2016)}。为了更高效的获取血液中的外泌体，需要提高基于外泌体的超顺磁性纳米粒子团簇(SMNC-EXOs)的形成效率。首先，以前使用透析的方法以清除血清中的游离配体，虽有助于获得高纯度的SMNC-EXOs，但该过程耗时较长，形成效率较低。因此需要选择适当的方法来缩短血清的预处理时间。另外，配体与超顺磁纳米颗粒(SPMNs)的直接连接使其之间存在一定的空间位阻效应，从而限制了瞄定在外泌体上的SPMNs的数量，进而减弱了SMNC-EXOs的磁相应强度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种快速分离外泌体的方法，即一种优化的基于超顺磁性纳米粒子团簇分离血清中外泌体的方法。具体而言，本发明使用超滤的方法快速有效的清除血清中的游离配体，从而缩短了体液的预处理时间；采用聚乙二醇(PEG)作为SPMNs与配体之间的间隔物，从而降低其之间的空间效应，提高了外泌体磁分离效率。

本发明的技术目的通过下述技术方案予以实现：