[发明专利]一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法

权利要求书

1.一种诱导桃儿七体细胞胚发生的方法，包括以下步骤：

将消毒后的桃儿七种子接种于种子培养基上进行暗培养5~7d，得到种胚，所述种子培养基为MS固体培养基，pH值为5.8；

将步骤1）得到的种胚接种于幼苗诱导培养基上进行幼苗诱导培养32~37d，得桃儿七无菌苗，所述幼苗诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括5.0mg/L的GA3、20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂，所述幼苗诱导培养基的pH值为5.6~5.8；所述幼苗诱导培养包括5~7天的暗培养和25~30天的光照培养；所述光照培养的光照强度为2000~3000lx，每天光照10~14h；

切取步骤2）得到的所述桃儿七无菌苗的下胚轴作为外植体，接入愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织培养，培养19~21d得到愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L 的2,4-D、1.0mg/L的KT、0.1~0.5mg/L 的NAA、4.55g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，pH为5.6~5.8；

将步骤3）得到的愈伤组织接种于胚性愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织胚性诱导培养40~50d，得到胚性愈伤组织；所述胚性愈伤组织诱导培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L 的6-BA、1.0mg/L 的GA3、0.1mg/L 的IAA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的琼脂和40g/L的蔗糖，pH值为5.6~6.2；

将步骤4）得到的胚性愈伤组织破碎，接种于体细胞胚诱导培养基上进行体细胞诱导培养29~31d，得到体细胞胚材料；所述体细胞胚诱导培养基以MS液体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L 的6-BA、0.1mg/L 的GA3、0.1mg/L 的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值为5.8；

将步骤5）得到的体细胞胚材料接种于成熟化固体培养基上进行成熟培养12~14d，得到成熟化体细胞胚材料；所述成熟化固体培养基为以MS固体培养基为基本培养基，包括1.0mg/L 的ABA、300mg/L的水解酪蛋白、4.55g/L的琼脂和40g/L的蔗糖，pH值为5.8；

将步骤6）得到的成熟化体细胞胚材料转入发育培养基上进行发育培养3~5d，得到发育的体细胞胚材料；所述发育培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括20g/L的蔗糖和4.55g/L的琼脂；

将步骤7）得到的发育的体细胞胚材料转入萌发培养基上进行萌发培养30d，得到发育状态相对一致的体细胞胚；所述萌发培养基以MS固体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.1mg/L 的IAA、300mg/L的水解酪蛋白和40g/L的蔗糖，pH值为5.8。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述暗培养的培养温度为22±1℃，培养湿度为40%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）所述愈伤组织培养的条件为光照强度为2000~3000lx，相对湿度为50~60%，培养温度为23±1℃，每天光照12h。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4）所述愈伤组织胚性诱导培养的条件为光照强度2000~3000lx，相对湿度50~60%，温度23±1℃，每天光照12h。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤5）所述体细胞诱导培养的条件为光照强度1200lx，培养温度23±1℃。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤6）所述成熟培养的条件为光照强度2000~3000lx，相对湿度50~60%，温度23±1℃，每天光照时间12h。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤8）所述萌发培养的条件为光照强度2000~3000lx，相对湿度50~60%，温度23±1℃，每天光照14h。

8.一种基于权利要求1~7任一项所述的方法获得完整植株的方法，包括以下步骤：将所述体细胞胚接种于丛生芽诱导培养基上进行诱导培养4~6周，形成丛生芽并进一步发育形成完整植株；所述丛生芽诱导培养基以1/2 MS固体培养基为基本培养基，包括0.5mg/L的6-BA、0.01mg/L的IAA、20g/L的蔗糖和4.6g/L的琼脂。