[发明专利]深色有隔内生真菌HS40及其在铁皮石斛生产上的应用

权利要求书

1.深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：包括深色有隔内生真菌HS40在促进铁皮石斛平皿培养苗生长上的应用和深色有隔内生真菌HS40在促进铁皮石斛盆栽苗生长上的应用；

所述的深色有隔内生真菌HS40的保藏编号为CGMCC NO.14345。

2.根据权利要求1所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：所述的深色有隔内生真菌HS40的分离包括以下步骤：

（1）样品采集：选择红树林优势树种-木榄进行采样，采用五点采样法采集木榄根、茎、叶部组织，放入4℃的冰盒中保存备用；

（2）培养基的配置：菌株分离培养基使用1/2玉米粉培养基；纯化培养基使用麦芽汁培养基或马铃薯培养基；宿主植物-西红柿种子催芽使用纯琼脂培养基；栽培西红柿以及培养真菌菌丝使用燕麦培养基；

（3）真菌的分离纯化：对采集到的样本组织进行清洗和表面消毒，将表面消毒后的植物组织块置于菌株分离培养基平板上，每皿3 块组织块，每个样本5皿，于25℃培养逐日观察是否有菌丝长出，待菌丝从组织块部位长出后及时转接到纯化培养基上，获得纯化的真菌菌株；

（4）内生真菌的筛选：为排除致病性菌和腐生菌，根据菌落形态、产孢结构将步骤（3）所述的纯化的真菌菌株进行分组，每组随机取一株代表菌株进行致病性测定，具体步骤如下：

（a）将菌株接种于燕麦培养基，每皿3个菌块，培养7−14d，得到培养好的菌落备用；

（b）真菌致病性检测用宿主植物-西红柿种子经表面消毒、在纯琼脂培养基上催芽，待种子发成幼苗后移栽至培养好的菌落上；

（c）在每个菌落上分别移栽1株无菌西红柿幼苗，每皿3株苗，将培养皿放入组培瓶中，于温度为26℃、光照强度为1000-1200Lx和光照时间为16h/d的培养箱中共培养；每个菌株共接种12株西红柿幼苗，即每个菌株设4个重复；

（d）以未接种菌株、直接移栽的西红柿幼苗的处理为对照；

（e）14d后记录西红柿幼苗的发病情况，并将西红柿根部洗净后放入50℃烘箱中烘干至恒重后称量干重；

（f）对不表现病症、生物量与对照差异不显著的菌株处理进行再分离，确定再分离菌株是否为原接种菌株；

（5）内生真菌根部定殖观察：选取上述步骤（4）中无病症的西红柿幼苗进行根部切片和棉兰染色，在显微镜下观察根组织中的菌丝分布、颜色和形态，初步明确内生真菌的定殖情况。

3.根据权利要求1所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：所述的深色有隔内生真菌HS40的鉴定方法包括以下步骤：

（1）通过形态学观察，初步判断其分类地位；

（2）是挑取菌丝直接用于PCR反应，rRNA的ITS1-5.8S-ITS4-28S部分区域PCR扩增采用通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和LR5(5′-TCCTGAGGGAAACTTCG-3′)；rRNA的18SrRNA区段PCR扩增采用引物NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)和NS4(5′-CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3′)，PCR反应体系：2×EasyTaq PCR SuperMix 25μL，20μmol/L正反引物各1μL，模板DNA 1μL，用ddH₂O定容至50μL。

4.根据权利要求3所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：步骤（2）所述的PCR反应的条件为：依次在98℃下反应2 min、在94℃下反应40s、在50℃下反应1min和在68℃下反应4min，30个循环，最后在72℃下反应10min。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的深色有隔内生真菌HS40在铁皮石斛生产上的应用，其特征在于：对在平皿培养中接种了HS40菌株的铁皮石斛苗，进行根部切片和棉兰染色，在显微镜下观察根组织中的菌丝分布、颜色和形态，以明确HS40菌株的定殖情况。