[发明专利]一种靶向沉默AEG‑1基因的siRNA的结构及其抗肺癌用途

权利要求书

1.一种靶向沉默AEG-1基因的siRNA的结构，其特征在于，所述siRNA为siRNA1、siRNA2或siRNA3中的一种；

所述siRNA1的序列为：

靶序列：5'-GTTACCACCGAGCAACTTA-3'，

正义链：5'-GUUACCACCGAGCAACUUAdTdT-3'，

反义链：5'-UAAGUUGCUCGGUGGUAACdTdT-3'；

所述siRNA2的序列为：

靶序列：5'-CTGACTGATTCTGGTTCAT-3'，

正义链：5'-CUGACUGAUUCUGGUUCAUdTdT-3'，

反义链：5'-AUGAACCAGAAUCAGUCAGdTdT-3'；

所述siRNA3的序列为：

靶序列：5'-GCCGTAATCAACCCTATAT-3'，

正义链：5'-GCCGUAAUCAACCCUAUAUdTdT-3'，

反义链：5'-AUAUAGGGUUGAUUACGGCdTdT-3'。

2.一种如权利要求1所述的靶向沉默AEG-1基因的siRNA的结构，其特征在于，所述siRNA为siRNA1，所述siRNA1的序列为：

靶序列：5'-GTTACCACCGAGCAACTTA-3'，

正义链：5'-GUUACCACCGAGCAACUUAdTdT-3'，

反义链：5'-UAAGUUGCUCGGUGGUAACdTdT-3'。

3.一种如权利要求1或2所述的靶向沉默AEG-1基因的siRNA，其特征在于，用于制备抗肺癌药物。

4.一种如权利要求1或2所述的靶向沉默AEG-1基因的siRNA，其特征在于，通过下述筛选步骤获得：

S1.检索AEG-1mRNA的序列，获取一系列siRNA序列；

S2.初选siRNA序列，获取siRNA候选序列，并对重复出现的siRNA候选序列进行重点标记；

其中，所述初选的标准包括：

(1)G/C含量在30％～52％之间；

(2)正义链3'端的15～19位碱基以A/T或A/U为宜，应含有3或3个以上的A/T或A/U；

(3)链内不存在重复或回文序列，溶解温度T值小于20％；

(4)正义链的19位首选A；

(5)正义链的3位首选A；

(6)正义链的10位首选U；

(7)正义链的19位不为G或C；

(8)正义链的13位不为G；

针对上述8条标准进行量化，满足标准(1)、(3)、(4)、(5)、(6)时各加1分，不满足标准(7)、(8)时各减1分，对于标准(2)，正义链的3'端的15～19位碱基每含一个A或U则加1分，得分超过6分的siRNA为siRNA候选序列；

S3.选择AEG-1mRNA二级结构上不稳定区域作为靶位，并排除与该区域结合的siRNA候选序列，获取siRNA潜在序列，其中，所述不稳定区域为发卡环、内部环、膨胀环或多分枝环中的一种或几种；

S4.将siRNA潜在序列与人、鼠的转录本数据库进行序列比对，筛选出与人、鼠同源性高于95％，且与人其他基因同源性低于20％的siRNA序列，获取siRNA；

S5.将siRNA转染进人肺癌A549细胞中，转染24h后提取RNA，并以GAPDH为内参，利用RT-PCR检测AEG-1的表达水平；

其中，所述GAPDH的引物序列为：

上游：5'-AAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'，

下游：5'-CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3'；

所述AEG-1的引物序列为：

上游：5'-AAATAGCCAGCCTATCAAGACTC-3'，

下游：5'-TTCAGACTTGGTCTGTGAAGGAG-3'；

S6.将siRNA转染进人肺癌A549细胞中，转染48h后收集细胞并提取总蛋白，利用Western Blot检测AEG-1的蛋白表达水平。