[发明专利]单细胞RT-PCR芯片及其制备方法

说明书

本发明提供的单细胞RT‑PCR芯片包括具有双套孔微阵列结构的基片；所述双套孔微列阵结构包括若干双套孔，该双套孔包括第一孔和位于第一孔内下方的第二孔；所述第二孔实现单细胞捕获，所述第一孔可以盛装反应液，作为RT‑PCR反应池。本发明提供的单细胞RT‑PCR芯片解决了传统单细胞微孔阵列中反应池体积小的问题，高效快捷地实现单细胞捕获与反应试剂进样；同时本发明芯片的结构简单、无需复杂的微流控液路，节省了成本，为单细胞RT‑PCR的产品化提供了最大的可能性。

技术领域

本发明属于单细胞研究领域，特别涉及一种采用单细胞PT-PCR芯片及其制备方法。

背景技术

1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家Kary.B.Mullis在迥然灵感的启迪下发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)，实现了在人体外无限扩增DNA片段的梦想。随后，Saiki首次应用PCR法成功地扩增出人的β-珠蛋白DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。

PCR是体外酶促反应合成特异性DNA的一种方法，它利用人工合成引物介导的DNA聚合酶促反应，扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。单细胞逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)，通过对单个细胞进行捕获、裂解、mRNA逆转录、目标基因片段PCR扩增以及结果检测分析，实现在基因水平上对细胞异质性的研究。通过对多个单细胞进行平行化的RT-PCR分析，可以对样品细胞群进行种类区分，此过程可运用于循环肿瘤细胞的检测、癌症预后监测等领域；高通量单细胞RT-PCR也可以对同类细胞其目标基因的表达差异进行定性和定量，此过程可运用于药物筛选等领域。

现有的单细胞研究手段可以分为三大类：单细胞微孔阵列芯片、油包水微流控芯片和结构设计精细的微流控芯片。

单细胞微孔阵列芯片采用在基片上刻蚀与单个细胞体积相仿的微孔，细胞在重力作用下进入微孔，由于微孔体积与单个细胞相仿，因此一个微孔只能捕获一个细胞。然而，进行单细胞RT-PCR的时候，需要足够的试剂(5nL/cell)进行实验。如果增大微孔的体积，将导致一个微孔中可能出现多个细胞的情况，即使可以通过稀释细胞悬浮液降低多细胞情况，但是这种泊松分布使得对微孔的利用率大大减小。

油包水微流控芯片是采用T型结构产生油包水体系，此方法单细胞占有率仍然限制于泊松分布，增大液滴体积使得单细胞占有率大大减小，而小体积的液滴由于微流控的密封结构，使得后期进液困难。

结构设计精细的微流控芯片，通过阀的开关控制可以多步进行液体控制，虽然此类芯片已成功应用于单细胞研究，但是其复杂的结构使得成本高、操作困难。

因此，设计一种高效、经济并且操作方便的芯片对于单细胞研究具有重要意义。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是为了提供一种单细胞RT-PCR芯片，以解决上述至少一项技术问题。

(二)技术方案

为实现上述目的，作为本发明的一个方面，本发明提供了一种单细胞RT-PCR芯片，该芯片包括：基片、盖片和密封圈。

在进一步实施方案中，所述基片具有双套孔微阵列结构，该双套孔微阵列结构包括若干双套孔，所述若干双套孔的阵列排布形式包括矩形、环形、镜像和密排等；

在进一步实施方案中，所述双套孔包括第一孔以及由第一孔底部部分区域进一步向下开设的第二孔。

在进一步实施方案中，所述第一孔的直径大于第二孔的直径；所述第一孔的深度大于、小于或等于第二孔的深度；