[发明专利]一种磁珠介导分离纯化的多步酶反应方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学实验技术领域，更特别地，涉及一种磁珠介导分离纯化的多步酶反应方法。

背景技术

20世纪50年代，DNA双螺旋结构的分子模型的建立，奠定了分子生物学的基础。由此，跟DNA相关的各种基因工程、酶工程等工程技术应运而生，尤其是DNA工具酶的发现，促使只能在细胞内完成的各种DNA为底物的酶反应能够在体外完成。随着二代测序技术的发展，将各种工具酶得到充分应用。不仅测序过程由酶反应来完成，测序前的各种各样的文库构建，更是由多种酶，多个酶反应来完成。

多步酶反应过程之间缓冲液等的不兼容性，导致每次酶促反应后需要将 DNA纯化。目前主要的纯化方式分磁珠纯化和硅胶柱纯化，市面上磁珠纯化以简便，通量大，操作简单，洗脱体积小等优势在酶反应后的DNA纯化基本替代硅胶柱纯化。见图1，目前以磁珠来纯化的多步酶反应的过程如下：向酶反应体系中加入磁珠，混匀后，将反应管放在磁力架上，移除液体，加入乙醇洗涤，然后洗脱磁珠上吸附的核酸；洗脱物转移至新反应管，在新管中配制第二步酶反应体系，再次加入磁珠，重复上述洗涤和洗脱步骤。

在多步酶反应中，每步酶反应都需要进行加入磁珠吸附核酸和从磁珠上洗脱核酸的的步骤，这种方式费时费力，还增加的磁珠成本，此外，在转移过程中容易造成交叉污染。

因此，需要一种新的多步酶反应方法。

发明内容

为解决以上问题，本发明提供了一种磁珠介导分离纯化的多步酶反应方法，其包括在从上一步酶反应体系转换为下一步酶反应期间直接将下一步酶反应体系与上一步分离的挂载有核酸磁珠混合的步骤。

本发明的方法省去了传统方法中每步酶反应结束后从磁珠洗脱核酸，然后在下次反应中再次加入磁珠的步骤，大幅节省了磁珠的用量，减少了操作步骤，缩短了操作时间。

在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：

S1：向装有第一步酶反应体系的反应管中加入磁珠悬液，混匀；

S2：第一步酶反应结束后，将所述反应管放置于磁力架上，待磁珠固定后，移除所述第一步酶反应体系；

S3：洗涤所述反应管和所述磁珠，从所述磁力架上取下所述反应管，并干燥；

S4：向所述反应管中加入第二步酶反应体系，混匀；

S5：第二步酶反应结束后，加入磁珠结合液,混匀，重复S2-S4，直至所有酶反应结束；

S6：用洗脱液从所述磁珠上洗脱核酸。

在一个优选实施方案中，S1中，添加的所述磁珠悬液的体积为所述第一步酶反应体系体积的0.6-3.8倍。

在一个实施方案中，S3中，使用70-85％的乙醇洗涤所述反应管和磁珠。 70-85％的乙醇中核酸不会溶解，但是可以去除其他杂质。

优选地，S3中洗涤2-5次。

在一个实施方案中，S3中在室温下干燥所述反应管及其中的磁珠。

在一个优选实施方案中，，S5中加入的磁珠结合液为PEG/NaCl磁珠结合液。

在一个实施方案中，S5中所加入的PEG/NaCl磁珠结合液的体积为当时的酶反应体系体积的0.6-3.8倍。

在一个实施方案中，所述核酸为DNA或RNA。

附图说明

图1为传统方法的流程图；

图2为本发明的方法的文库构建时间和磁珠用量与传统方法的比较柱状图；

图3为不同操作人构建的文库浓度统计图；

图4为不同操作人构建的文库片段分布图；

图5为不同操作人GC含量、唯一比对率、重复率、可用数据率统计图；

图6为本发明的方法与传统方法胎儿浓度比较；

图7本发明的方法与传统方法GC含量比较；

图8为本发明的方法与传统方法的数据可用率比较；

图9为本发明的方法与传统方法的重复率比较；

图10为本发明的方法与传统方法的唯一比对率比较；

图11为本发明的方法和传统方法构建的文库测序片段分布图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

本实施例的方法流程如下：

1)纯化磁珠室温平衡，颠倒混匀，在第一步酶反应体系中加入0.6-3.8 倍体积的磁珠，吹打混匀10次；室温放置5-10min；

2)将反应管放置在磁力架上，静置5min，吸出和磁珠分离的废液，加入200ul新鲜配制的80％乙醇，放置30sec；