[发明专利]一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料及其应用

说明书

本发明公开一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料及其应用，其特征在于：以多孔蚕丝蛋白支架为主体，以生物硅化作用对支架进行有机硅包被，作为人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化的培养载体，采用人骨髓间充质干细胞为种子细胞，将人骨髓间充质干细胞按一定细胞密度接种到硅包被多孔蚕丝蛋白支架上，并将硅包被多孔蚕丝蛋白支架置于成骨诱导分化微环境中进行培养；该支架材料所建立的三维成骨诱导分化体系，不但可以用于骨组织工程定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，更为高效地获得性状稳定的成骨细胞，而且还可为骨组织工程的研究提供重要的理论指导，进而为临床上骨质疏松、骨损伤等骨科疾病的攻克提供了新思路。

技术领域

本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种人骨髓间充质干细胞体外培养支架材料，及其应用。

背景技术

骨髓间充质干细胞因其取材容易、易于体外培养增殖，同时具有良好的成骨、成软骨、成脂肪甚至肌原细胞分化潜能，成为骨组织工程研究领域最重要的种子细胞，具有广泛的应用前景。

定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，对骨组织工程的研究提供重要的理论指导，进而为临床上骨质疏松、骨损伤等骨科疾病的攻克提供了新思路。

相关诱导BMSCs特异性成骨分化研究也已经取得诸多进展，已成功应用多种支架材料进行成骨诱导分化，但目前可促进成骨分化的高机械强度支架材料多为人工合成材料，其难形成理想的材料-细胞界面，影响种子细胞在材料的黏附、增殖、分化，同时材料的机械强度和降解速度之间的矛盾还无法解决且材料在体内仍有一定的抗原性；而更有利于细胞生长增值的天然支架材料可塑性差、机械强度较弱。因此仍需要更多机械强度合适的天然支架来高效获得性状更为稳定的成骨细胞，这将有利于生物工程获得更多骨组织样结构，并启发其未来在骨缺损替代疗法中的应用。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种能够理想维持人骨髓间充质干细胞生长活性，并显著提高人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化表型与功能的硅包被多孔蚕丝蛋白支架材料。

具体的，所述的间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料，其制备方法包括下述步骤：

以多孔蚕丝蛋白支架为主体，以生物硅化作用对支架进行有机硅包被，作为人骨髓间充质干细胞体外成骨诱导分化的培养载体；

所述多孔蚕丝蛋白支架的制备方法包括，将蚕茧于0.02M碳酸钠溶液中进行萃取并溶解于9.3M溴化锂溶液中，蒸馏水透析并离心，得到2.5g/mL丝素蛋白溶液。将甘油溶液与上述制备的丝素蛋白溶液以3:7的重量比预混合。将所得混合物倒入不锈钢容器中，并冷冻干燥后切片使用。在-40℃下预冷冻6小时冻干36小时后，将所得的支架切成小圆片(3mm直径×1mm厚)，即多孔蚕丝蛋白支架。本发明所述的多孔蚕丝蛋白支架的制备方法在下述文献中有所记载Mingzhong Li,Shenzhou Lu,Zhengyu Zu,Haojing Yan,Jingyu Mo,Lihong Wang.Study on porous silk fibroin materials:1fine structure of freeze-dried silk fibroin.Applied Polymer Science,2001,79(12):2185-2191。

优选的情况下，对于上文所述支架材料的制备方法中，多孔蚕丝蛋白支架置于硅酶(silicatein)溶液中，在2-8℃条件下浸泡6-18h后，将硅酸钠、六氟硅酸钠、四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷按照上述含硅化合物与硅酶质量比5～50:1的比例，加入溶液中，经25-37℃反应1-6h，PBS洗去反应液。上述含硅化合物与硅酶质量比理论上应该是5～100:1都可以的，本发明实施例中所用的比例是30:1。

优选的情况下，对于上文所述的支架材料的制备方法中，在接种细胞前所述支架材料需经灭菌处理，且浸泡在基础培养基内进行预平衡10-14h。