[发明专利]一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料及其应用

权利要求书

1.一种间充质干细胞体外成骨诱导分化的支架材料的制备方法，其特征在于：制备方法包括下述步骤：

(1)制备多孔蚕丝蛋白支架：将蚕茧于0.02M碳酸钠溶液中进行萃取并溶解于9.3M溴化锂溶液中，蒸馏水透析并离心，得到2.5g/mL丝素蛋白溶液；将甘油溶液与上述制备的丝素蛋白溶液以3:7的重量比预混合；将所得混合物冷冻干燥后切片获得多孔蚕丝蛋白支架；

(2)将所述多孔蚕丝蛋白支架置于硅酶溶液中，在2-8℃条件下浸泡6-18h后，按照含硅化合物与硅酶质量比5～50:1的比例，加入溶液中，经25-37℃反应1-6h，PBS洗去反应液得硅包被多孔蚕丝蛋白支架；其中，所述含硅化合物选自硅酸钠、六氟硅酸钠、四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷；所述硅酶的氨基酸序列来自繁茂膜海绵的silicatein alpha蛋白基因。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述冻干为在-40℃下预冷冻6小时后，冻干36小时。

3.权利要求1所述的制备方法在间充质干细胞培养方法中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将人骨髓间充质干细胞以10⁵～10⁶细胞数/支架接种到硅包被多孔蚕丝蛋白支架上，并置于成骨诱导分化微环境中进行培养。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：还包括将消化的人骨髓间充质干细胞与胶原混合，获得细胞-胶原悬液后再接种至硅包被多孔蚕丝蛋白支架的步骤；且人骨髓间充干细胞数量为2～5×10⁵细胞数/支架，胶原的体积为5～15μL/支架。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：将硅包被多孔蚕丝蛋白支架置于成骨诱导分化微环境中进行培养的操作步骤如下：在37℃、5％CO₂的条件下凝胶化10～20min，然后加入成骨诱导培养基进行细胞培养，所述的成骨诱导培养基由高糖基础培养基、10％胎牛血清、1％双抗、100nM地塞米松、10μMβ-磷酸甘油、0.5μM抗坏血酸混合而成。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：在将人骨髓间充质干细胞接种到硅包被多孔蚕丝蛋白支架前所述支架需经灭菌处理，且浸泡在基础培养基内进行预平衡10-14h。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述灭菌处理方法选自高温或高温高压灭菌方法，或乙醇灭菌方法。