[发明专利]一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置及方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，具体涉及一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置及方法。

背景技术

脂肪细胞的数量和体积不仅直接影响家畜的肉品质，更与人类的健康密切相关，由肥胖引起的糖尿病、高血压、动脉粥样硬化等疾病已成为危害人类健康的主要杀手，对人类的生存和发展造成巨大威胁，因此研究脂肪细胞的增殖和分化的分子机理具有重要意义。众所周知，脂肪细胞的分化起始于中胚层多潜能干细胞，经过前体脂肪细胞(脂肪母细胞、前脂肪细胞和不成熟脂肪细胞3个阶段)逐渐发育为成熟脂肪细胞。一直以来，人们认为成熟脂肪细胞是一种终末分化的细胞，不具有分裂增殖能力和利用价值。然而，近年来的研究发现，当成熟脂肪细胞用天花板方法培养时，其表型会发生逆转，自发去分化为具有增殖能力的DFAT细胞，并且这种细胞体外可向多个方向分化，包括成脂、成软骨、成骨、成肌、成神经和成血管等。同时，由于去分化脂肪(DFAT)细胞比骨髓来源间充质干细胞更容易获得，比脂肪来源基质细胞纯度更高，DFAT细胞已成为组织工程理想的细胞来源，并已在多个动物模型上取得研究成果。因此，将成熟脂肪细胞在体外更好的培养到去分化状态的DFAT细胞成为目前研究的新的发展方向。

针对于此，现已有发明利用成熟脂肪细胞具有浮力，而去分化后的脂肪细胞恢复其贴壁能力的特点在培养瓶中对其进行去分化培养，称为“天花板”法。该法培养成熟脂肪细胞去分化虽然操作简单但是耗费较大，需要将整个培养瓶都充满细胞培养液，容易造成浪费而且不利于细胞培养过程中培养瓶内外的气体交换，不利于细胞的生长，且操作过程中容易出现漏液，加大了细胞污染的危险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置及方法。本发明提供的装置培养成本低、细胞污染率低、操作方便，细胞生长好，有利于后期实验的开展。

本发明提供了一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置，包括培养皿(1)、皿盖(2)和离体设置的敞口小室(3)；所述小室在脂肪细胞贴壁培养阶段使用时倒置于培养皿中且能够完全没入培养皿中，在脂肪细胞贴壁增殖培养阶段使用时，与培养皿离体正置放置。

本发明还提供了一种基于上述技术方案所述装置的成熟脂肪细胞去分化培养方法，包括以下步骤：

将成熟脂肪细胞液加入到培养皿中，再将小室倒置于培养皿中，使小室中充满成熟脂肪细胞液，倒置进行脂肪细胞贴壁培养6～7天，待50～60％的细胞贴于小室上壁，将小室正置，去掉培养皿，皿盖盖于小室上进行贴壁增殖培养3～7天，得到去分化脂肪细胞。

优选的是，所述成熟脂肪细胞液的制备方法包括以下步骤：

将脂肪细胞剪碎，加入质量浓度为0.25％的胰蛋白酶消化液进行消化，所述消化后用含体积浓度为20％胎牛血清的DMEM培养基终止消化，得到消化细胞液；

用孔径为250μm的尼龙网筛过滤所述消化细胞液，将过滤得到的细胞液在1200r/min转速下离心10min，弃沉淀，离心得到的顶层悬浮液为成熟脂肪细胞液。

优选的是，所述质量浓度为0.25％的胰蛋白消化液的体积与脂肪细胞的质量比为(0.5～1)mL：1g。

优选的是，所述脂肪细胞贴壁增殖培养过程中每2d换液一次。

优选的是，换液用培养基为含体积浓度20％胎牛血清的DMEM培养基。

优选的是，所述整个培养过程的条件为：37℃，5％CO₂。

本发明提供了一种成熟脂肪细胞去分化培养的装置。本发明所述装置将小室倒置于培养皿中，小室的顶部代替了培养瓶的“天花板”，有效地减少了利用“天花板”法培养成熟脂肪细胞去分化时培养液的使用量，既达到了诱导成熟脂肪去分化的效果又避免了不必要的浪费。同时，由于培养过程中培养皿内培养液不会充满整个细胞培养皿，因此也就避免了阻碍装置内外气体的交换；整个装置为半封闭装置，细胞在培养的过程中不会直接与空气接触，操作过程中也不会出现漏液等现象，有效的防止了细胞污染；且倒置的小室能够置于培养皿中，当细胞贴壁后，取出再正置培养，这样便解决了换液和传代过程中的操作不便的问题。

附图说明

图1为本发明提供的成熟脂肪细胞去分化培养的装置结构图；

图2为本发明提供的成熟脂肪细胞去分化培养装置培养细胞示意图；

图3为本发明提供的成熟脂肪细胞去分化培养原理图；

图4为本发明实施例1提供的成熟脂肪细胞去分化培养流程图。

具体实施方式