[发明专利]一种检测沙门氏菌磁共振成像试剂盒的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学检测领域，具体涉及一种检测沙门氏菌磁共振成像试剂盒的制备方法。

背景技术

沙门氏菌是细胞内寄生的一种革兰氏阴性肠道菌，也是一种常见的人畜共患病原菌。该菌广泛存在于自然界中，极易污染食品、水源及畜产品，不但能引发家畜家禽等动物发生急性、慢性或隐性感染，还能导致人体感染产生沙门氏菌病，对人类造成很大的威胁。自1885年Salmon和Smith分离到猪霍乱沙门氏菌以来，对沙门氏菌病的研究已有百余年。沙门氏菌不但能引起沙门氏菌病，而且与人类多种疾病密切相关。在我国沙门氏菌感染率很高，在细菌性食物中毒中70~80%是由沙门氏菌引起的，因此沙门氏菌的检测一直是沙门氏菌研究的核心问题。

检测沙门氏菌的传统方法是将食物样品分步增菌法，这种方法需要预增菌、选择性增菌和分离三个不同的阶段，检测周期长，并且检测灵敏度低。通过聚合酶链式反应（PCR）进行体外DNA扩增的分子生物学方法是一种快速、高灵敏、简便、高特异性的检测方法，然而用PCR检测沙门氏菌的特异性较差，在扩增沙门氏菌DNA的同时许多其他的肠道杆菌能同时被扩增出来，因此特异性引物的设计是此方法成功的关键。基于抗原抗体反应的免疫学方法在食品微生物中广泛应用，使用抗沙门氏菌的抗体与沙门氏菌特异性识别反应，在较短的时间内就可以对沙门氏菌进行准确的测定。传统的酶联免疫方法主要是通过过氧化物酶催化底物显色进行结果的分析，因此在特定抗体的使用条件下，通过酶促反应很难再次提高检测的灵敏度。要想提高酶联免疫方法的检测灵敏度，寻求新的检测信号是实现此目的的关键。

发明内容

要解决的技术问题：基于抗原抗体的酶联免疫方法利用过氧化物酶催化底物显色作为检测信号，限制了检测的灵敏度，不能进一步降低目标物的检测限。

技术方案：本发明公开了一种检测沙门氏菌磁共振成像试剂盒的制备方法，包括如下步骤：

（1）沙门氏菌检测抗体修饰磁纳米粒子

将沙门氏菌检测抗体修饰生物素分子，磁纳米粒子修饰链霉亲和素，通过生物素和链霉亲和素的亲和识别与结合将沙门氏菌检测抗体修饰到磁纳米粒子上。

（2）沙门氏菌磁共振成像试剂盒的制备

将沙门氏菌捕获抗体包被酶标板，加入沙门氏菌被酶标板上的捕获抗体捕获，再加入检测抗体修饰的磁纳米粒子形成捕获抗体—沙门氏菌—检测抗体—磁纳米粒子的复合物，通过磁共振成像进行检测。

本发明所述的沙门氏菌检测抗体修饰磁纳米粒子的步骤为：

（1）沙门氏菌检测抗体修饰生物素

将沙门氏菌检测抗体用pH8.6 0.05M的醋酸盐缓冲液透析3次，然后再用pH8.6 0.05M的醋酸盐缓冲液将抗体稀释到1mg/mL，取1mL抗体在其中加入150μL浓度为1mg/mL的生物素-N-琥珀酰亚胺基酯，在37℃条件下振荡反应3h，然后加入20μL 1M的NH₄Cl溶液，置于室温条件下放置20min使得反应终止，再将抗体用pH7.4 0.01M的PBS缓冲液透析3次，以除去多余的生物素分子。

（2）磁纳米粒子修饰链霉亲和素

将1mg/mL的15nm羧基基团修饰的磁纳米粒子用pH6.5的MES缓冲液稀释20倍，取5mL磁纳米粒子溶液，加入35mg N-羟基琥珀酰亚胺和55mg碳二亚胺，在缓慢振荡的条件下进行羧基活化，活化1~4h后，外加磁场吸附磁纳米粒子，并去除上清用等体积的pH7.4 0.01M的PBS缓冲液将磁纳米粒子进行重悬，然后加入1mg链霉亲和素溶液，在室温条件下继续振荡反应2~4h，最后外加磁场吸附磁纳米粒子，除去上清再用等体积的PBS磁纳米粒子进行重悬。

（3）沙门氏菌检测抗体修饰的磁纳米粒子

将步骤（1）和步骤（2）得到的溶液充分混合，在37℃条件下反应1h，使得生物素和亲和素充分结合，然后外加磁场吸附磁纳米粒子去除上清，再用抗体稀释液将磁纳米粒子进行重悬，从而得到抗体修饰的磁纳米粒子。

本发明所述的沙门氏菌磁共振成像试剂盒的制备流程为：

（1）沙门氏菌捕获抗体包被酶标板

用包被缓冲液将沙门氏菌捕获抗体稀释成1μg/mL，加入酶标板中每孔加100μL，在37℃的烘箱中孵育2h，然后用PBST洗液进行3次洗涤拍干，得到沙门氏菌捕获抗体包被的酶标板。

（2）沙门氏菌的检测以及双抗体夹心体系的形成