[发明专利]一种唾液中皮质醇的检测方法

权利要求书

1.一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)样品的处理：测试前30min将样品于20～30℃的条件下解冻，然后用离心机离心，再通过纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氯乙烯复合微滤膜过滤，过滤完成分别用去离子水稀释成0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液；

2)样品的准备：取包被板设置样品孔格5个，编号Y0、Y2、Y4、Y8、Y16，用移液枪各自移取0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、8ng/ml、16ng/ml的样品稀释液50ul分别加入Y0、Y2、Y4、Y8、Y16孔格，并设置空白孔格5个；

3)浓缩：用移液枪吸取50ul的酶结合物分别加入样品稀释液的孔格中，用封板膜覆盖所有孔格，充分振荡1min，然后放入37℃的恒温培养箱中培养40～50min，得到浓缩混合液；

4)稀释：将3)中得到的浓缩混合液分别倒入烧瓶中，加入35倍体积的去离子水，充分振荡1min，得到稀释混合液，然后分别用稀释混合液加满包被板上的孔格，静置10min后倒回烧瓶，如此重复10次；

5)显色：先用移液枪吸取50ul显色剂A液分别加入样品稀释液的孔格中，再用移液枪吸取50ul显色剂B液分别加入样品稀释液的孔格中，充分振荡1min，于20～30℃的条件下显色10min后，在样品稀释液的各个孔格中分别加入50ul的终止液，其中显色剂A液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和过氧化氢的混合溶液，显色剂B液包括：PBS缓冲液、柠檬酸、ED-TA乙二氨四乙酸、ProcLin-300和硫代硫酸钠的混合溶液；

6)测定：以5个空白孔格调零，将包被板放入分光光度计测定样品的吸光度。

2.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤3)、步骤4)、步骤5)中所述的振荡均采用超声波振荡，超声波功率为80W，震荡频率为40KHz。

3.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤1)中所述唾液离心的条件为：温度5℃～10℃,转速2200r/min～2500r/min,离心时间10min～15min。

4.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤6)所述的测定过程中，每隔3min测试一次，连续测试三次，取平均值。

5.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：步骤6)中测定样品的检测波波长均为420nm。

6.根据权利要求1所述的一种唾液中皮质醇的检测方法，其特征在于：1)中所述的经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜的制备方法如下：

步骤一，称取聚偏氟乙烯粉末，于60℃下搅拌溶解在N,N-二甲基乙酰胺溶液中，得到聚偏氟乙烯溶液，再取聚偏氟乙烯1％～2％重量的氧化石墨烯加入N,N-二甲基乙酰胺溶液中，超声波分散10h，得到氧化石墨烯溶液，然后将氧化石墨烯溶液加入聚偏氟乙烯溶液，超声波分散10h，得到铸膜液；

步骤二，取步骤一中得到的铸膜液于真空条件下脱气1h，然后使用刮膜器在无纺布上平铺200um厚的铸膜液，于空气中停留20s，再将无纺布浸入20℃的去离子水中凝固，然后用去离子水反复冲洗、干燥，得到氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜；

步骤三，取纳米羟基磷灰石加入容器中，加入30倍体积的二甲基甲酰胺分散均匀，再加入纳米羟基磷灰石1％重量的浓硫酸，充分搅拌，得到纳米羟基磷灰石分散液；

步骤四，取步骤二得到的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜浸入步骤三得到的纳米羟基磷灰石分散液中，加入纳米羟基磷灰石1％～2％重量的TPO-L 2,4,6-三甲基苯甲酰基苯基膦酸乙酯，用紫外光辐照5min，同时用超声波充分振荡，得到经纳米羟基磷灰石改性的氧化石墨烯/聚偏氟乙烯复合微滤膜，然后用去离子水反复浸泡洗涤复合微滤膜，真空干燥即可。