[发明专利]一种体外快速优化菌株代谢通路的方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种体外快速优化菌株代谢通路的方法。本发明利用Cre‑loxP位点特异性重组的特性，通过在功能基因片段和接收载体引入改进的loxPsym序列实现基因的随机插入，从而获得随机插入的DNA，形成多样性的重排质粒文库，能够实现多个代谢通路功能基因的随机组合，避免各功能基因合成长片段DNA的过程，高效快速的实现多个功能基因的联合分析，快速优化代谢通路，寻找关键基因并且不受宿主限制，应用领域广。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及一种体外快速优化菌株代谢通路的方法。

背景技术

DNA测序技术的普及，揭示了越来越多物种的全基因组信息，此外，转录组、蛋白质组、代谢组等相关组学技术的发展使得科学家们对生物细胞内各种复杂的代谢通路以及精细的调控机制有了更深刻的认知。例如酿酒酵母生产β-胡萝卜素的必须基因元件为GGPP合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB、八氢番茄红素脱氢酶基因crtI以及番茄红素环化酶基因crtY；酿酒酵母生产番茄红素的必须基因元件为GGPP合酶基因crtE、八氢番茄红素合成酶基因crtB和八氢番茄红素脱氢酶基因crtI；酿酒酵母生产紫色杆菌素的必须基因元件为vioA、vioB、vioC、vioD和vioE。

合成生物学的深入研究加速了绿色无污染有机化学品细胞工厂的开发。在工业菌株的改良上，已经可以通过摸索发酵条件、优化细胞代谢通路等措施来降低成本、提高产量。

在微生物工业中，虽然生产的化学品性质各异，对工业菌株的要求也各不相同，但商业目的都是在同等生产条件下获得相对高产的菌株。在长期生产实践中，对工业菌株已经摸索到最佳的发酵条件，单纯通过改变外界环境提高产量上升空间不大，必须对菌株自身进行根本性改良，即改造菌株的基因。传统基因工程，往往通过改变代谢通路中的某个基因的表达水平，或通过调控机制的优化来提高产量，但存在成本高和研发周期久、资源消耗大的缺点。

在许多情况下，编码相关生物合成酶的基因多是未知的，并且常常出现于一个操纵子中或以基因簇的形式出现。而且参与生物合成的酶又常常是一些多酶复合体系，因此利用常规蛋白质工程或体外定向进化技术，很难对这些生物合成途径进行理性化的改造以提高产量或产生新的同系物，因为除了蛋白质工程的难度外，测定途径的限速步骤是非常费力和不确定的。而DNA重排则非常适合于优化这样的途径，因为整个代谢途径能当作一个单元进行进化，而无需了解限速步骤以及对蛋白质的结构和功能方面更为详细的分析。利用DNA重排，通过多种突变，可以有效协调一个代谢途径中不同的相互作用，使总的代谢效果迅速进化，这是其他策略所无法完成的。

由于位点特异性重组系统具有高效精确的优点,在基因工程领域得到了广泛的应用。位点特异性重组酶识别特定的位点形成联会复合体，并发生DNA链的切割与交换，实现靶位点之间的整合、切离或倒位。这一过程由位于重组酶催化活性中心的酪氨酸或丝氨酸向DNA磷酸骨架发起攻击，形成共价中间体，不需要高能量辅助因子的参与。

目前，位点特异性重组酶做为工具酶的体外应用主要有Creator系统和基于λ整合的Gateway系统。Gateway系统在Int和IHF的作用下attB和attP发生重组，再加入Xis即发生attL和attR之间的逆向重组。利用这一原理和一对突变的位点，Hartley等人设计了通过两步克隆高效快速构建表达载体的Gateway系统。同时其载体上均带有自杀基因ccdB，宿主只有正确重组克隆转入后才能生长,方便筛选。Creator系统设计类似Gateway系统，二者均应用于基因克隆和表达，但仅能针对单个基因进行功能性研究，同时基因重排的多样性也不够丰富。因此，亟待开发一种可以针对多个基因功能联合研究的体外随机重组方法，增加基因重排的多样性，以此可以快速优化菌株的代谢通路，高效快速实现多个功能基因的联合分析，指导以后的菌株构建工作。

发明内容