[发明专利]CCBE1蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用、直肠癌预后评估试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CCBE1蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用、直肠癌预后评估试剂盒及方法。

背景技术

直肠癌是指从齿状线至直肠乙状结肠交界处之间的癌，是消化道常见的恶性肿瘤之一。直肠癌位置低，容易被直肠指诊及乙状结肠镜诊断。但因其位置深入盆腔，解剖关系复杂，手术不易彻底，术后复发率高，中下段直肠癌与肛管括约肌接近，手术时很难保留肛门及其功能是手术的一个难题，也是手术方法上争论最多的一种疾病。我国直肠癌发病年龄中位数在45岁左右，青年人发病率有升高的趋势。

直肠癌是由直肠组织细胞发生恶变而形成。随着生活质量的提高，直肠癌的发病率逐年增加，有报道大肠癌(结肠癌+直肠癌)的发病率位列第三位(前两位是肺癌及胃癌)，到2018年大肠癌的发病率可能超过肺癌及胃癌的发病率，位列第一。因此，关于直肠癌的诊断及治疗的研究是非常重要的课题。

直肠癌的发生发展及预后与癌基因的激活和抑癌基因功能失活密切关联，是多因素诱导，多基因参与的复杂病理过程。近年来，直肠癌早期复发转移的分子机制是该领域的热门课题，深入阐明该分子机制，并在其特异性环节中导入靶向性治疗措施，有望很大幅度提高直肠癌术后总体治疗效果。因此，探寻切实有效的直肠癌直肠切除术后早期复发相关预警分子标志，阐明其与直肠癌早期复发转移的关系，这对提高直肠癌术后治疗效果、评估直肠癌早期复发风险、判断预后和个体化治疗有着至关重要的意义。

胶原蛋白和钙结合表皮生长因子结构域1(CCBE1)是一种新发现的肿瘤因子，有报道发现CCBE1基因低表达与卵巢癌的肿瘤分化程度、病理分级和低存活率密切相关，也有报道发现CCBE1能够作为淋巴管生成因子，在胚胎期促进斑马鱼的淋巴管发育和生成。然而，目前对于CCBE1在肿瘤中的作用尚不清楚。

发明内容

本发明目的在于提供CCBE1蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用，并提供用于直肠癌术后预后评估的试剂盒及方法。

直肠癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而CCBE1做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道CCBE1蛋白与判断直肠癌预后或直肠癌转移相关。

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测CCBE1蛋白在直肠癌组织中的相对表达量，能够判断直肠癌患者出现直肠癌复发转移的风险。基于CCBE1蛋白表达量与直肠癌复发转移的相关性，以CCBE1蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导直肠癌的预后判断。

因此，本发明提供了CCBE1蛋白在制备直肠癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是以CCBE1蛋白作为分子标记，利用CCBE1单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测CCBE1蛋白在直肠癌组织中的相对表达量。

本发明还提供了所述应用中用于直肠癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：用于对直肠癌组织中的CCBE1蛋白的相对表达量进行检测的人源CCBE1单克隆抗体或CCBE1多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。

本发明经过研究发现，CCBE1在复发转移直肠癌组织中表达高于未复发转移直肠癌组织，可以推测CCBE1在直肠癌术后复发转移发挥重要作用。查阅国内外文献，CCBE1与直肠癌的发生以及复发转移的相关研究少。在本研究中，CCBE1在直肠癌组织中的表达上调，而在癌旁和正常直肠组织中的表达则下调，且与未复发转移组相比，CCBE1在复发转移组中表达也上调，表明CCBE1可能作为促进因子参与直肠癌发生发展过程。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，CCBE1表达程度与直肠癌患者的预后有关，CCBE1高表达的患者预后不良(P<0.05)。

综上所述，CCBE1在直肠癌组织中高表达，CCBE1的高表达与直肠癌患者术后复发转移有关。CCBE1可以作为直肠癌预后的一个重要候选分子标记物。

优选的，所述人源CCBE1多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的CCBE1蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H₂O₂(水溶液)、3％BSA封闭液(以PBS配制)、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、PBS(pH7.4)、0.01M EDTA修复液。

利用本发明所述试剂盒进行直肠癌术后预后评估的方法如下：