[发明专利]一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法

说明书

本发明公开一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，具体为：在加入无菌采血袋的抗凝剂中添加80～120ng/ml环孢素A，在羟乙基淀粉溶液沉降剂中添加30～70ng/ml环孢素A，于密封的低氧工作站内进行造血干细胞的全程提取过程；所述低氧工作站设有两侧独立的操作台和一个转移闸，两侧操作台氧气浓度设置为3～8％，一侧操作台温度设为3～10℃，用于进行包括试剂的配制和分装、脐带血的转移、脐带血造血干细胞的冻存，另一侧操作台温度设为18～25℃，用于进行包括脐带血的沉降、脐带血的分浆、分浆后的离心。本发明方法可提取获得数量更多、状态更原始、增殖和分化能力更强的造血干细胞。

技术领域

本发明涉及脐带血造血干细胞的提取方法，具体涉及一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法。

背景技术

造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSC)是一小群具有高度自我更新和多向分化潜能的造血前体细胞。目前已证实HSC至少能分化成12个系列的血细胞及其它细胞，包括红细胞、粒细胞、单核细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞、肥大细胞、血小板、淋巴总细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞，以及骨髓中的成骨细胞及成纤维细胞。所以，造血干细胞移植是治疗恶性血液性疾病和某些免疫疾病的重要手段。目前，用于临床的造血干细胞主要来源于骨髓和脐带血。

脐带血是胎儿娩出、脐带结扎并离断后才残留在胎盘和脐带中的血液，通常是废弃不用的。近年研究发现，脐带血中含有可以重建人体造血和免疫系统的造血干细胞，可用于造血干细胞移植。与非血缘骨髓移植相比，脐带血移植具有以下优点：(1)脐带血来源丰富；(2)采集方便，对产妇和胎儿无任何损害；(3)与非血缘骨髓库不同，脐带血是以实物的形式保存，不会被供者拒绝；(4)寻找HLA相合脐带血所需时间短，可根据患者需要及时进行移植；(5)脐带血中免疫细胞不成熟，移植后急、慢性GVHD的发生率低且严重程度较轻，可耐受较大的HLA差异，故脐带血库较骨髓库需要较少的供者；(6)脐带血中各种病毒感染的机会较小，移植后病毒性疾病发生率低。

然而，目前脐带血用于临床存在不足之处，其中最关键的技术瓶颈是脐带血血量有限，细胞数量少，此外，正常的造血干细胞驻留在骨髓、脐带血、胎盘的低氧环境中，但目前几乎所有的造血干细胞研究都是在非生理条件的环境空气(即常氧)中进行的，其中包括造血干细胞的分离和提取，然而暴露在环境空气中会造成非生理学氧气应激(EPHOSS，extraphysiologic oxygen shock/stress)，当细胞内氧气浓度突然升高，细胞内多种活性氧(ROS)增高，正常细胞对氧化应激做出反应，导致P53积累于线粒体基质，触发线粒体通透性转换孔(mPTP)开启，使得膜电化学梯度瓦解，凋亡因子释放入细胞质中，最终导致细胞凋亡，会降低造血干细胞的收集和扩增过程的细胞得率，同时会促进干细胞的分化。综上，传统方法收集到的造血干细胞数量是严重低于实际含量的，且原始性低，大大限制了其在成人移植上的应用。

因此，如何从脐带血中提取到数量更多、状态更原始、增殖能力更强的造血干细胞是解决上述问题的关键，也是目前行业内亟待解决的技术问题。

发明内容

针对传统脐带血造血干细胞提取方法存在的弊端，申请人进行研究及改进，提供一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，该方法可提取获得数量更多、状态更原始、增殖和分化能力更强的脐带血造血干细胞。

为了解决上述问题，本发明采用如下方案：

一种在低氧环境下提取脐带血造血干细胞的方法，其特征在于：在加入无菌采血袋的抗凝剂中添加80～120ng/ml环孢素A，在羟乙基淀粉溶液沉降剂中添加30～70ng/ml环孢素A，于密封的低氧工作站内进行造血干细胞的全程提取过程；所述低氧工作站设有两侧独立的操作台和一个转移闸，两侧操作台氧气浓度设置为3～8％，一侧操作台温度设为3～10℃，用于进行试剂的配制和分装、脐带血的转移、脐带血造血干细胞的冻存，另一侧操作台温度设为18～25℃，用于进行脐带血的沉降、脐带血的分浆、分浆后的离心。