[发明专利]一种利用OsDCL3b提高稻米中蛋白质和氨基酸含量的方法

权利要求书

1.一种利用OsDCL3b干涉载体提高稻米中蛋白质和氨基酸含量的方法，其特征是包括以下步骤：

(1)干涉载体构建：利用引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；在水稻幼穗cDNA中采用RT-PCR扩增出OsDCL3b基因的正向干涉片段SEQ ID NO.3，正向干涉片段SEQ ID NO.3与干涉载体pYL均经过BamH I和Hind III两种酶进行双酶切、纯化、回收后，再用T4 DNA酶进行连接反应，连接产物转化大肠杆菌Top10F′感受态细胞，挑选阳性单菌落，经摇菌后提取质粒获得中间载体pYL-1，利用引物序列SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5对pYL-1进行PCR扩增，获得反向干涉片段，随后再用MluI和PstI酶对反向干涉片段和pYL-1进行双酶切、经纯化回收后，再用T4 DNA连接酶进行连接后，转化Top10F′感受态细胞，挑选阳性单菌落，摇菌提取质粒获得干涉载体pYL-2；经引物序列SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7进行PCR扩增，扩增产物经测序验证后干涉载体构建成功；

(2)将水稻OsDCL3b基因的干涉载体pYL-2，通过原生质体转化、Ti质粒、植物病毒载体、DNA直接转化或显微注射方法转化水稻愈伤组织或者细胞，再培育成转基因水稻植株，经过荧光定量PCR或Northern blot方法检测OsDCL3b基因下调表达，获得OsDCL3b基因下调表达的水稻，经凯式定氮法测定稻米中蛋白质含量和经氨基酸自动分析仪测定大米中氨基酸含量，进而获得的高蛋白质和氨基酸含量的水稻植株；

其中：

SEQ ID NO.1：5’-AATTGGATCCGGTAAAGGGAAATTGTTCC-3’；

SEQ ID NO.2:5’-CCGGAAGCTTTGCAGTTGTGTCTAAGATCA-3’；

SEQ ID NO.4：5'-CACCCTGACGCGTGGTGTTACTTCTGAAGAGG-3'；

SEQ ID NO.5：5'-ACTAGAACTGCAGCCTCAGATCT ACCATGG TCG-3'；

SEQ ID NO.6：5’-ACATGTTGATGTGGGTTTTACTGA-3’；

SEQ ID NO.7：5’-CACTGGATCAATGTC GTGAAAG-3’。