[发明专利]一种改良酚抽提总RNA的方法

说明书

本发明公开了一种改良酚抽提总RNA的方法，通过裂解细菌菌体、经水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为25:24:1抽提获得总核酸，再使用pH值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液与总核酸混合，最后通过水饱和酚：氯仿：异戊醇体积比为125:24:1抽提纯化出不含基因组DNA的总RNA。该方法的提取过程简单，无需使用DNA酶消化去除总核酸中的基因组DNA；提取得到的总RNA样品的纯度高，扩增能力较强。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种改良酚抽提总RNA的方法。

背景技术

随着分子生物学的不断发展，高质量RNA样品是很多实验的关键所在。而一些实验如逆转录PCR(RT-PCR)、基因芯片等，更需要高纯度高质量的RNA样品。稳定高效的RNA提取方法对于相关实验研究至关重要。

最为经典的抽提RNA的方法当属“酚抽提法”，然而，目前学术界对于酚抽提过程中pH值的定义并不明确，甚至有些错误的认识。《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，科学出版社2002，第1587页提到所谓酚相的pH值，但实际上酚是一种有机溶剂，并非水溶液，所以酚相的pH值是没有意义的。

一种常用于抽提RNA的“酸性酚”，是使用固定pH值的酸性缓冲液(醋酸钠或者柠檬酸钠缓冲液)对水饱和酚进行反复的平衡，直至最终平衡之后的水相缓冲液pH值不再变化。这种“酸性酚”制备十分费时费力，而且在实际使用中，这种“酸性酚”对于去除RNA样品中基因组DNA的残留效果也并不稳定。

如何利用酚抽提方法，在合适的条件下精准地将DNA和RNA分离，成为了目前亟待解决的问题。

发明内容

基于以上背景，本发明提供了一种改良酚抽提总RNA的方法，通过裂解细菌菌体、第一次酚抽提获得总核酸，再使用pH值为3.85±0.10的酸性醋酸钠溶液与总核酸混合，最后通过第二次酚抽提纯化出不含基因组DNA的总RNA。

本发明采取的技术方案为：

一种改良酚抽提总RNA的方法，包括如下步骤：

a)使用重悬液重悬需要提取的生物材料；

b)加入与重悬液体积相同的裂解液，室温裂解3-5分钟，或65℃裂解0.5-1分钟；

c)加入与a)b)两步中溶液总体积相等的酚抽提液1，反复振荡混匀；12000r/min离心10-15分钟；吸取上清液；

d)向c)步骤所得上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇，上下反复颠倒，待充分沉淀；12000r/min离心10分钟；弃上清；

e)向d)步骤所得的沉淀中加入洗涤液，洗涤1～2次，再用超纯水溶解沉淀，所得即为总核酸溶液。

f)取e)步骤中的总核酸溶液，加入与总核酸溶液等体积的酸性醋酸钠溶液，以及等体积的氯化钠溶液；

g)加入同f)步骤中溶液等体积的酚抽提液2，反复混匀之后，12000r/min离心5-10分钟；吸取上清液；

h)向g)步所得的上清液中加入两倍上清液体积的无水乙醇，颠倒混匀，待沉淀完全后，12000r/min离心10分钟；弃上清；

i)加入洗涤液洗涤一次后，加入超纯水溶解沉淀，所得即为RNA样品。

步骤a)中，所述重悬液为超纯水；所述生物材料为细菌菌体，菌体与重悬液的质量/体积比为20-50mg/100μL，以避免菌体过多造成纯化困难和菌体过少导致产物得率下降。

步骤b)中，所述裂解液为十二烷基硫酸钠溶液，其重量浓度为2±0.2％。选用十二烷基硫酸钠溶液作为裂解液裂解较为简单，且优于其他一些裂解法，比如异硫氰酸胍+酚作为裂解液的裂解。