[发明专利]一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法

说明书

本发明提供了一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法，所述测定方法包括如下步骤：(1)将交联透明质酸或其盐在透明质酸酶的作用下发生酶解反应，生成寡糖和二糖；(2)用液相色谱联合紫外吸收，分离和检测所述寡糖和二糖，得到吸光度‑保留时间色谱图，分别测定所述寡糖和二糖的色谱峰面积；(3)其中A₁为所述寡糖的色谱峰面积，A₂为所述二糖的色谱峰面积。本发明提供的测定方法能够实现对交联透明质酸或其盐的交联度的直接测定，测定结果稳定可靠，具有较高的可重复性。

技术领域

本发明属于化学分析技术领域，具体涉及一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法。

背景技术

透明质酸(HA)是由葡糖醛酸和乙酰基氨基葡糖双糖单位重复连接组成的链状聚阴离子黏多糖，它是构成玻璃体、皮肤、关节滑液和软骨组织的重要成分，参与多种细胞活动和生理过程。由于HA具有良好的保湿性、润滑性、黏弹性、非免疫原性以及对药物吸收的促进作用，因此在临床上得到了广泛应用。但是天然的HA存在水溶性强、在组织中易扩散和被酶降解、体内存留时间短等缺点，而经修饰和交联后得到的HA衍生物则可弥补这些缺陷。一些交联HA产品已被成功应用于预防术后粘连、治疗骨关节炎、软组织填充、组织工程和药物控释。

交联透明质酸钠是交联透明质酸钠上糖环活性基团与交联剂在一定条件下反应，交联形成的凝胶大分子，也称为交联玻璃酸钠凝胶，是交联HA衍生物的一种。交联反应是大分子包含空间多位点的复杂反应。交联透明质酸钠的理化性质与交联度的大小密切相关。因此，交联度是控制交联透明质酸钠产品质量的指标之一。

目前，对于交联HA凝胶或交联透明质酸钠凝胶中交联剂残留量这一指标已有一定研究。如CN 105606602A公开了一种测定交联透明质酸钠凝胶中二巯基聚乙二醇残留的方法，葛翠兰等(“交联透明质酸凝胶中交联剂的HPLC测定”，葛翠兰，《上海生物医学杂志》，2006年第27卷第4期，第223-225页)公开了一种交联透明质酸钠凝胶中二乙烯基砜残留量的测定方法，CN 103630536A公开了一种测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法，CN 106053369A公开了一种医用交联透明质酸钠凝胶中游离透明质酸钠含量的检测方法，CN102435708A公开了一种交联透明质酸水凝胶中交联剂1，2，7，8-二环氧辛烷残留量的测定方法。但是，上述方法均只能检测凝胶中残留的交联剂的含量，或定性分析交联的程度，而无法用于交联度的测定。

因此，在本领域期望得到一种能够直接测定交联透明质酸或其盐的交联度的方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法。该方法能够直接测定交联透明质酸或其盐的交联度。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一种交联透明质酸或其盐的交联度的测定方法，包括如下步骤：

(1)将交联透明质酸或其盐在透明质酸酶的作用下发生酶解反应，生成寡糖和二糖；

(2)用液相色谱联合紫外吸收，分离和检测所述寡糖和二糖，得到吸光度-保留时间色谱图，分别测定所述寡糖和二糖的色谱峰面积；

(3)计算交联度，其中A₁为所述寡糖的色谱峰面积，A₂为所述二糖的色谱峰面积。

本发明中，对交联透明质酸及其盐的交联方式没有特殊限制，示例性地可以是以二乙烯基砜、二巯基聚乙二醇或其组合作为交联剂进行交联。以二巯基聚乙二醇交联的透明质酸钠为例，其酶解反应式如下：