[发明专利]一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法

说明书

本发明公开了一种脯氨酸4‑羟化酶及其应用。具体地，本发明提供了一种多肽在生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸或以反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸为前体的下游产物中的用途，所述多肽是：(a1)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽，并且具有催化L‑脯氨酸生成反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的功能；或(b1)从SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽衍生的多肽,由SEQ ID NO:1所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成，并且具有(a1)所述多肽的功能。本发明还提供了表达所述多肽的反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸生产菌株及其构建方法，以及生产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体地说，本发明涉及具有脯氨酸4-羟化酶活性的蛋白、编码该蛋白的基因和包含该酶或其编码基因的基因工程菌以及它们在生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。

背景技术

反式-4-羟基-L-脯氨酸(简称羟脯氨酸),是一种具有独特生理活性的氨基酸,易溶于水，广泛应用于医药、化工、动物饲料和美容业等领域，市场前景广阔，由于价格昂贵羟脯氨酸目前主要用于合成碳青霉烯类抗生素(美罗培南等)的侧链。碳青霉烯类是第三代抗生素，是抗菌谱最广的一类非典型β-内酰胺类抗生素，具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点，全球总体市场已超过了30亿美元。

反式-4-羟基-L-脯氨酸可以通过脯氨酸4-羟化酶催化L-脯氨酸羟基化来生产，目前用于生产L-脯氨酸等氨基酸的工程菌主要是谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、大肠杆菌(E.coli)等，但是这些菌都没有编码脯氨酸4-羟化酶的基因。因此，挖掘能够在L-脯氨酸生产菌中表达并具有高效催化活性的脯氨酸4-羟化酶是实现反式-4-羟基-L-脯氨酸工业生产的关键。

日本协和发酵公司通过筛选得到一株脯氨酸4-羟化酶酶活最高的指孢囊菌，并命名为指孢囊菌RH1，测序获得脯氨酸4-羟化酶基因序列(CN96190335)；该脯氨酸4-羟化酶在大肠杆菌中异源表达主要形成包涵体，进行密码子优化后置于一个强启动子的调控下，导入到大肠杆菌中，添加外源L-脯氨酸，在发酵罐中转化100h后，反式-4-羟基-L-脯氨酸的积累量达到41g/L，转化效率只有87％(Shibasaki,Takeshi,Hideo Mori,and Akio Ozaki.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecifichydroxylation of L-proline.Bioscience,biotechnology,and biochemistry 64.4(2000):746-750)。为了进一步降低反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产成本，日本协和发酵公司又将密码子改造的指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟化酶基因导入到L-脯氨酸生产菌中，在以葡萄糖为底物的发酵培养基中培养99h后反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到25g/L，发酵温度为33℃，发酵过程L-脯氨酸最高积累量达到7.8g/L，初步实现了反式-4-羟基-L-脯氨酸的从头合成(CN97117929.8和Shibasaki,Takeshi,et al.Construction of a novelhydroxyproline-producing recombinant Escherichia coli by introducing aproline 4-hydroxylase gene.Journal of bioscience and bioengineering 90.5(2000):522-525.)，该文献水平为目前报道的最高水平。

然而，目前报道的具有工业应用前景的脯氨酸4-羟化酶只有来源于指孢囊菌RH1的脯氨酸4-羟化酶。指孢囊菌属于放线菌，是一种高GC含量的革兰氏阳性细菌，指孢囊菌RH1脯氨酸4-羟化酶基因的GC含量为74％，并且含有大肠杆菌的稀有密码子。因此，指孢囊菌的野生型脯氨酸4-羟化酶在原核生物，例如大肠杆菌中重组表达时主要以没有活性或活性很低的包涵体形式存在，经过密码子优化后的突变型脯氨酸4-羟化酶在表达量和催化性能上依然较差。