[发明专利]一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法

说明书

本发明公开一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法，包括如下步骤：1)获得携带目的基因的发根农杆菌菌苔，利用液体共培养培养基悬浮菌苔，调节OD600值在0.6～1.0；2)将在萌发培养基中萌发的大豆种子沿种脐剖开获得半种子，将半种子放入步骤1)制备的含有悬浮菌苔的液体共培养培养基中，侵染15～30min；3)步骤2)侵染后的半种子布于空培养容器中，23～25℃黑暗共培养3～5天；4)步骤3)共培养后的半种子切去根部，布于培养基中，23～25℃黑暗培养，长出根后，选取长度为4～6cm的阳性根切下单独培养。本发明所述方法操作时间短，简单高效，发根率高，阳性率高；且外植体不容易被农杆菌和其他杂菌污染。

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种高效率农杆菌介导大豆根毛转化方法。

背景技术

发根农杆菌(Agrobacteriam rhizogenes)是一种革兰氏阴性土壤细菌，能够感染大多数双子叶植物。植物被发根农杆菌侵染后会产生许多生长迅速的不定根，称为毛状根或发状根^[4]。发根农杆菌在植物转基因研究中具有重要的应用价值,其通过植物伤口感染，其T-DNA随机插入宿主细胞染色体中，与宿主细胞的基因共同表达，诱导植物产生毛状根^[1]。

早在1907年Smith和Townsend发现发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)能诱导植物形成毛状根(hairyroot),1934年Hildebrand在对苹果树的研究中再次阐述了该现象^[2]。对发根农杆菌真正意义上的深入研究应追溯到1982年Chilton报道在发根农杆菌侵染植物的过程中，在感染部位上或附近能产生大量副产物——发状根^[3]。这种发状根又称毛状根,毛状根是由发根农杆菌含有的Ri(root inducing)质粒引起的^[5]。自从Ri质粒被人们发现并认识以来,它已广泛应用于植物基因工程、植物品种改良、植物次生代谢产物生产和植物栽培等领域,显示出了极其广阔的应用前景。

野生型发根农杆菌K599是由澳大利亚学者Allen Kerr从土壤中分离而得^[5]，Savka M A等和Cho H J等用9个起源于美国的大豆基因型和1个起源于我国的野生大豆基因型(Peking)作为材料,研究发现K599能有效地诱导大豆离体子叶生根^[6]。

目前，发根农杆菌侵染大豆的的方法分为针刺注射法和子叶侵染法。但上述方法操作繁琐，容易被农杆菌及其他杂菌污染，而且假阳性率高。其中，针刺注射法是利用注射器将侵染菌液注射入生长一周左右大豆子叶、茎等部位。该方法发根数量较少，假阳性较高，环境条件影响较大。子叶侵染法是将生长一周左右的无菌苗子叶切下，并在子叶背部做物理切伤，并与菌液共培养。该方法操作繁琐，容易被农杆菌及其他杂菌污染。

因此，寻找一种利用组织培养的方法，在实验室条件下规模化进行转化大豆工作，且操作要求低、转化效率高的转化方法尤为重要。

参考文献

[1]CHILTON M D，EPFER D A，PETIT A，et a1.Agrobacterium rhizogenesinserts T-DNA into the genomes of the host plant root cell[J].Nature，1982，295：432.

[2]GEORGIEV V.Improved procedure for nucleus extraction for DNAmeasurements by flow cytometry of red beet(Beta vulgaris L.)hairy roots[J].Journal of Bioscience and Bioengineering，2009，107：439 441.