[发明专利]血清总胆汁酸含量测定试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化检测领域，特别是涉及一种借助于测定材料的化学物理性质来测定材料的试剂盒。

背景技术

1974年挪威科明公司采用提纯的3α-羟类固醇脱氢酶(3α-HSD)成功地生产出第一代胆汁酸酶法试剂，使胆汁酸的测定真正进入临床领域。此后，挪威科明和日本第一化学将第一代试剂改进试剂组分，采用启动试剂，发展了第二代胆汁酸测定试剂，之后，日本第一化学从假单胞菌属中提纯出的3-氧-5β-类甾醇-△4脱氢酶(△4DH)与3α-HSD偶联开发出第三代胆汁酸测定试剂盒。

中国专利CN1281983申请公开了一种血清总胆汁酸测定试剂，该试剂是由含有硝基四氮唑蓝、氧化型辅酶Ⅰ、黄递酶、丙酮酸钠、磷酸盐的缓冲液构成的试剂Ⅰ；和由含有3α-HSD、人血清白蛋白、EDTA、磷酸盐缓冲液的溶液构成的试剂Ⅱ组成。其测试原理是利用3α-HSD，黄递酶将胆汁酸分子脱下的氢传递到硝基四氮唑蓝，后者还原后生成蓝色的化合物，供比色检测分析。该专利中提供的试剂，采用黄递酶和硝基四氮唑蓝组合，易污染比色杯及堵塞生化分析仪管道，其测定灵敏度也偏低，受血液中还原性物质及酶类的干扰严重；且试剂为冻干粉制剂，试剂复溶后的稳定时间短，临床使用不方便。

中国专利申请CN1378077A公开了一种总胆汁酸测定方法和测定试剂，提供了一种总胆汁酸测定的方法即酶循环法，其反应原理是利用3α-HSD和硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)特异性氧化胆汁酸，生成3-酮类固醇和还原性硫代氧化型辅酶(Thio-NADH)；在3α-HSD存在的条件下，3-酮类固醇和还原型辅酶Ⅰ(NADH)又生成胆汁酸和氧化型辅酶(NAD)每一次循环比原来的反应提高一倍的灵敏度，如此往复循环，从而放大微量的胆汁酸，产生大量的水溶性非染料的硫代还原型辅酶Ⅰ(Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，测得胆汁酸的含量。

该发明使用方便、消除干扰明显、灵敏度高，对生化仪器管道无污染，使其在胆汁酸的准确、快速测定中有重要的意义。该发明中提供的试剂，在2-8℃开盖使用状态下，试剂稳定的时间较短；在2-8℃度密闭避光存储的过程中，试剂稳定性不理想，随着放置时间的延长，反应度会下降，试剂颜色由无色或淡黄色逐渐变成红色。

因此有必要开发一种新的具有良好稳定性和检测准确性的总胆汁酸测定试剂盒。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种稳定性强、准确度高、无干扰的血清总胆汁酸含量测定试剂盒及其使用方法。

本发明涉及一种血清总胆汁酸含量测定试剂盒，所述试剂盒包括试剂1和试剂2；

所述试剂1包括：

所述试剂2包括：

优选地，所述试剂1包括：

所述试剂2包括：

优选地，所述复合稳定剂包括吐温80 10-13g/L，谷氨酸20-30g/L，谷胱甘肽1-3g/L，海藻糖50-60g/L，十二烷基二甲基甜菜碱2-6g/L，卵磷脂3-6g/L，缓冲液100-120mmol/L；其为申请号为201610166107.2的多种抗体的复合稳定剂及其使用方法中的复合稳定剂。

本发明试剂盒是采用酶循环法定量检测样本中总胆汁酸的含量。具体反应原理如下：

利用3ɑ-羟类固醇脱氢酶(3ɑ—HSD)的可逆性催化胆汁酸与3-酮类固醇和还原型辅酶Ⅰ(NADH)又生成胆汁酸的互变特点建立的酶循环法。样本中的胆汁酸被3α-HSD和硫代氧化型辅酶(Thio-NAD)特异性氧化，生成3-酮类固醇和还原性硫代氧化型辅酶(Thio-NADH)；此外，在3α-HSD存在的条件下，3-酮类固醇和还原型辅酶Ⅰ(NADH)又生成胆汁酸和氧化型辅酶(NAD)，如此不断循环往复，进而使原本微量的胆汁酸得到放大，同时产生大量的水溶性非染料的硫代还原型辅酶Ⅰ(Thio-NADH)，最后测定生成的Thio-NADH的吸光度变化，测得胆汁酸的含量，其反应原理如图1所示。

本发明还涉及一种血清总胆汁酸含量测定试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：

该试剂盒的测定方法为速率法；

(1)将240份试剂1和4份待测样品混合均匀，37℃孵育后得到反应液1；

(2)然后加入80份试剂2混合均匀，37℃孵育得到反应液2；