[发明专利]生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用。本发明利用重组载体以及农杆菌介导真空渗透方法来表达人凝血八因子(anti‑hemophilic factor(AHF),FVIII)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法、免疫印迹法(Western法)确定重组FVIII成功表达。凝血实验证明生菜生产的FVIII具有生物学活性。本发明提供了一种低成本、方便、大量生产具有活性重组人FVIII的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用。

背景技术

人凝血八因子(FVIII)因子VIII是非正常血液凝固所必需的非酶血浆蛋白。人类因子VIII活性的不足与先天性出血性疾病(称为血友病A)有关。患者是因为缺乏凝血因子(大多数患者缺乏“八因子”，少数患者是缺乏“九因子”或“十一因子”)而流血不止，如得不到及时治疗，发病症状为出血部位疼痛难忍、留下残疾甚至死亡但只需要注射凝血八因子，血友病人就可以像正常人一样生活。也就是说，八因子是治疗血友病A的特效药，也是必须用药，不管有多少风险，都应该使用，否则就会有生命危险，而如果没有八因子治疗，则患者本身的生存就会有危险。血友病A患者用八因子治疗，可维持正常止血。但令人遗憾的是，预防性治疗在全世界并不普遍。

目前，我国市场上凝血八因子均为从血液中获得，通过两步灭活生产工艺提取凝血八因子。由于血源供应不足，导致凝血八因子产量远远达不到临床的需求量，致使凝血八因子价格快速上涨。好多血友病人由于缺乏凝血八因子而导致苦苦挣扎，甚至死亡。而且，血浆中潜在的病原体如肝炎和艾滋病毒导致从目前从血浆中来源的凝血八因子存在各种风险。为了消除血浆病原体以及病毒污染的潜在风险，利用基因工程技术生产重组八因子(rFIII)可以作为大规模生产一种更安全以及低成本的FIII从而取代血浆来源的八因子。

植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白ELELYSO^TM(taliglucerase alfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。

植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物， ZMappTM，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。ZMapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达人凝血八因子具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了凝血八因子(FVIII)，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产重组人凝血八因子。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了生菜作为宿主在表达凝血因子中的应用。