[发明专利]生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用。本发明利用重组载体以及农杆菌介导真空渗透方法来表达血清白蛋白(HSA)。该表达体系确定植物外源蛋白在农杆菌侵染4d后就可以收集。利用SDS‑PAGE法、免疫印迹法(Western法)确定重组HSA成功表达。细胞增值实验证明生菜生产的HSA具有生物学活性。本发明提供了一种低成本、方便、大量生产具有活性重组人HSA的方法。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用。

背景技术

人血清白蛋白(HSA)是一种可溶性，球状和非糖基化的单体蛋白。HSA 是单体球状前原蛋白，其成熟形式由585个氨基酸(66.5kDa，17个二硫键) 的单个多肽链组成。它主要用作类固醇，脂肪酸和甲状腺激素的载体蛋白，并且在稳定细胞外液体体积中起重要作用。HSA是最广泛使用的静脉注射蛋白质，在临床上广泛用于治疗严重烧伤，出血性休克，低蛋白血症，胎儿成红细胞增多症和肝硬化引起的腹水。HSA还可用作疫苗或治疗性蛋白质药物的赋形剂，也可用作疫苗和药物生产中的细胞培养基补充剂。近来已经探索了生物应用中HSA的许多其他新用途，例如氧的载体，药物的纳米转运和多肽的融合。身体中白蛋白量的减少将导致不同种类的疾病，如血容量不足和低蛋白血症。

目前，世界各地的HSA市场年度需求估计超过500吨。HSA的商业生产主要是基于收集的人血浆，通过血清分馏而产生。由于血源供应不足，导致HSA产量远远达不到临床的需求量，致使HSA价格快速上涨。而且，血浆中潜在的病原体如肝炎和艾滋病毒导致从目前从血浆中来源的HSA存在各种风险。为了消除血浆病原体以及病毒污染的潜在风险，利用基因工程技术生产重组HSA(rHSA)可以作为大规模生产一种更安全以及低成本的HSA。

植物作为药物蛋白质的表达和生产系统，已经研究了近三十年。除了低成本和产量高等的优点外，基于植物的表达系统还降低了人和动物病原体从产生蛋白质的过程中传播到人类的风险。此外，植物真核蛋白内膜表达系统和分泌途径类似于哺乳动物细胞。植物表达系统可大量生产大分子量以及多亚基的药物蛋白质，且大大优于原核生物表达系统，比如大肠杆菌表达系统。如需要翻译后修饰的，糖基化的蛋白，以及需要组装的单克隆抗体，其不能用原核系统实现。利用植物生产的药用蛋白作为生物试剂已经商业化，或用作家禽的疫苗添加剂。2012年，美国食品和药物管理局(FDA)批准了用于治疗遗传疾病1型戈谢病的蛋白ELELYSO^TM(taliglucerase alfa)，而这种蛋白是利用胡萝卜生产的。在过去十年中，人们对药物蛋白质的需求急剧增加，所以FDA批准用于临床试验的植物药用蛋白质的数量也在不断增加。

植物瞬时表达系统可以大量生产重组蛋白用于临床研究或者应对突发性疾病。2014年，唯一用于有效抵抗埃博拉病毒爆发的抗体治疗药物， ZMappTM，就是农杆菌渗透方法在烟草叶片中生产。ZMapp的功效和安全性为推动植物制药业的行业开辟了道路。目前，烟草瞬间蛋白表达最常见的宿主植物，并且已经开发了各种载体和农杆菌渗透方法，用于在短时间内进行大规模生产。然而，烟草具有高纤维含量和潜在的有毒化合物，如生物碱尼古丁，显著增加了下游纯化过程中的成本，极大地阻碍了植物外源蛋白药物的进一步发展。与烟叶系统相比，生菜中含有更少的酚类和有毒化合物，因此，将生菜作为宿主在表达血清白蛋白具有重要的现实意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用。本发明利用生菜作为重组蛋白生产的有效平台，消除了植物生长周期，大大节省了前期培育植物的时间。本发明用生菜系统表达了HSA，并且在温和的条件下成功分离出有活性的外源蛋白，证明生菜表达平台可以用来生产重组人血清白蛋白。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了生菜作为宿主在表达血清白蛋白中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中，所述人血清白蛋白为人血清白蛋白。