[发明专利]一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物纳米技术检测领域，具体是一种基于磁性仿酶纳米材料和噬菌体表面展示的多肽配体的材料及其对病原微生物在免疫比色检测中的应用。

背景技术

近年来，已经发现有成千上万种致病微生物威胁到食品安全和人类健康、甚至国家安全。过度使用抗生素导致大量耐药致病微生物不断产生，进一步加速了致病微生物的危害。其中，最为常见的危害是由致病微生物感染导致的食源性疾病，严重威胁人类健康且给经济造成重大影响，现已成为目前国际上最突出的公共卫生问题之一。常见的食源性致病菌主要包括大肠埃希式菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌、肉毒梭菌等。其中金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus，S.aureus)是污染水源和食品的最主要微生物之一，也是全球公共医疗保健体系中最普遍、危害最大的致病菌。因此，研究和发展金黄色葡萄球菌的检测技术，对食源性疾病的治疗和预后有重要意义。

由于污染的食品中致病菌的数量通常较少，加上食品成分复杂，传统方法不能满足快速、特异检测的要求。因此，开发一种低成本、不需要特殊仪器的的可视化方法，使其既能够直接从复杂的食品样品中高效特异地分离出数量极少的食源性致病菌，又能够实现对目标菌高灵敏和高特异的检测，有望实现大规模检测食源性致病菌的目的。

仿酶纳米材料(又称纳米酶)，是一类同时具有纳米材料的独特性能和催化功能的模拟酶。自2007年Fe₃O₄纳米酶报道以来，纳米酶，特别是金属氧化物纳米酶的研究迅速崛起，研究的涉及面也逐渐广泛，目前已经包括化学、生物、材料科学、物理、医学和环境等不同领域，因而具有潜在而又广泛的应用前景。

作为一种金属氧化酶纳米酶，MnO₂具有较好的形貌和优良的仿过氧化酶活性，且对于污染海产品中的致病微生物可实现灵敏、特异检测(申请号201710036540.9，公开号CN106771194A)。然而初被污染的食品中致病微生物数量通常非常少，所以单纯依靠金属氧化物纳米酶的仿酶活性很难实现对食品中痕量致微生物菌高灵敏度、高特异的直接检测。因此，开发一种低成本、不需要特殊仪器的方法，使其既能够直接从复杂的食品样品中高效特异地分离出数量极少的致病微生物并将其浓度进行富集，又能够实现对目标微生物高灵敏和高特异的检测，有望实现及时发现并抑制食品中微生物的污染。合成具有磁性分离效果的纳米酶有望成为实现该目的的方法。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料及其材料对病原微生物在免疫比色检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料，将pVIII融合蛋白(fusion pVIII)组装在四氧化三钴纳米材料的表面，即获得仿酶纳米材料；所述仿酶纳米材料fuison pVIII与四氧化三钴磁性纳米材料的摩尔比例为1000:1。

所述四氧化三钴纳米材料为以牛血清白蛋白(BSA)为模板采用生物模板法合成表面氨基化的四氧化三钴纳米材料Co₃O₄纳米花(Co₃O₄NFs)；

所述展示pVIII融合蛋白的噬菌体为利用生物淘选技术从风景噬菌体文库中筛选出与金黄色葡萄球菌特异性结合的噬菌体单克隆，并分离纯化展示有特异性多肽的pVIII融合蛋白。

所述噬菌体表面展示多肽配体以食源性致病菌金黄色葡萄球菌为靶标，利用生物淘选技术从风景噬菌体f8/9文库进行淘选，并通过特异性测试，获得能够特异性识别金黄色葡萄球菌的噬菌体单克隆，进一步的通过饱和酚分离纯化展示有特异性多肽的fusion pVIII。其中，生物淘选技术共经过3轮严格的淘选过程。

所述多功能仿酶纳米材料通过酰胺键将fusion pVIII与四氧化三钴磁性纳米材料表面连接构建得到。

一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料的制备方法：仿酶纳米材料通过酰胺键将fusion pVIII结合到四氧化三钴磁性纳米材料表面。

一种基于噬菌体表面展示多肽配体和磁性仿酶纳米材料的应用，所述仿酶纳米材料在磁泳富集分离或免疫比色检测病原微生物中的应用。