[发明专利]一种溶液中枸橼酸含量的高通量测定方法

说明书

技术领域

本发明属于生化分析和医学检验领域，具体涉及一种溶液中枸橼酸含量的高通量测定方法。

背景技术

枸缘酸又称柠檬酸(H3cit)，是一种重要的有机酸，无色晶体，常含一分子结晶水，无臭，有很强的酸味，易溶于水。枸缘酸的用途非常广泛，用于食品工业占生产量的75％以上，可作为食品的酸味剂、抗氧化剂、pH调节剂、用于清凉饮料、果酱、水果和糕点等食品中。用于医药工业占10％左右，主要用作抗凝血剂、解酸药、矫味剂、化妆品等。用于化学工业等占15％左右，用作缓冲剂、络合剂、金属清洗剂、媒染剂、胶凝剂、调色剂等。在电子、纺织、石油、皮革、建筑、摄影、塑料、铸造和陶瓷等工业领域中都有十分广阔应用价值。鉴于枸缘酸如此广泛的应用价值，则对于枸橼酸的检测为多个行业所需要。

医学领域中，枸橼酸又与人类的健康息息相关。如枸橼酸及其盐在泌尿系统结石的形成和预防中起着十分重要的作用。枸橼酸，具有3个羧基和1个羟基，羧基之间的距离为3个C-C键长度，在溶液中，H3cit可与Ca²⁺离子形成含有1个五元环和1个六元环的螯合物，其稳定常数为4.79×10⁴。H3cit及其盐与尿液中Ca²⁺离子形成难以离解的高度可溶性枸橼酸钙后，可以随尿液排出体外，从而降低尿钙的浓度和尿中草酸钙及磷酸钙的饱和度。结石患者的尿液中，H3cit浓度降低，这使得其尿中离子钙分数升高，CaO_Xa(草酸钙)的过饱和度增大形成含钙结石。研究表明，一些泌尿系统钙盐结石患者常有低枸橼酸尿症。因此检测尿液中枸橼酸含量对于结石病的诊断及一些治疗结石病的药物的疗效评估都具有重要的价值。

目前24h尿生化指标中，无机离子的检测较为简单，而尿枸橼酸则为有机酸，含量低，检查难度较大，目前国内外现有常用方法为比色法和滴定法，该两种方法灵敏度低，难以对尿液样品中微量的草酸、枸橼酸进行准确的定量分析，且常用的变色酸比色法需用浓硫酸，化学比色法需用溴，对工作人员及环境均有影响，这两种测量方法除操作复杂外，还得一个样品、一个样品的依次单个进行检测，一次性检测的通量有限。HPLC法测定样品前，需对尿液进行预处理，需要加入浓盐酸酸化旨在防止维生素C等在中性或碱性环境下转化为草酸而影响测定结果，还要加入磺基水杨酸可除去尿样中少量的蛋白，减少杂峰的干扰，样品的预处理过程复杂繁琐，而且浓盐酸的添加需要在通风厨等特定设施里操作，否则易挥发刺激人体影响环境(HPLC法同时测定尿液中草酸和枸橼酸含量的方法学评价及临床应用)。市场上虽有试剂盒基于酶解反应再逐个测定反应紫外吸光光度值，然而该试剂盒需要借助于比色皿，比色皿检测不仅样品的消耗量都很大，不经济，费用昂贵，而且还是要利用公式逐个计算样品结果的方法对枸橼酸进行检测，操作耗时不便，效率也低。总之，上述这些现有的枸橼酸检测方法存在着一定的不足，在医学和生化检验方面应用起来缺乏便利性，实际操作难度大。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于提供一种更为便利、高效率、经济省样本的溶液中枸橼酸含量的检测方法。

本发明提供一种溶液中枸橼酸含量的高通量测定方法，包括以下步骤：

(1)配制不同浓度梯度的枸橼酸标准品；

(2)配制含有L-苹果酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的酶解反应液A液；

(3)配制含有枸橼酸裂解酶的酶解反应液B液；

(4)在多孔紫外微孔板的各孔中加入所述酶解反应液A液；

(5)向所述多孔紫外微孔板的各孔分别加入枸橼酸标准品和一个以上的待测样品，反应一段时间后，置于酶标仪上在特定紫外波长下读取各枸橼酸标准品微孔的吸光度值A_STD1、以及待测样品微孔的吸光度值A_SP1；

(6)在所述多孔紫外微孔板的各孔中再加入酶解反应液B液，反应一段时间后，置于酶标仪上在所述特定紫外波长下读取各枸橼酸标准品微孔的吸光度值A_STD2、以及待测样品微孔的吸光度值A_SP2；

(7)将各枸橼酸标准品微孔的A_STD1和A_STD2的差值ΔA与各枸橼酸标准品的浓度进行回归拟合来构建标准曲线；

(8)将A_SP1和A_SP2的差值插入所述标准曲线，得到对应的浓度，即可得到待测样品的枸橼酸含量。