[发明专利]一种溶液中枸橼酸含量的高通量测定方法

权利要求书

1.一种溶液中枸橼酸含量的高通量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）配制不同浓度梯度的枸橼酸标准品；

（2）配制含有L-苹果酸脱氢酶、L-乳酸脱氢酶和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的酶解反应液A液；

（3）配制含有枸橼酸裂解酶的酶解反应液B液；

（4）在多孔紫外微孔板的各孔中加入所述酶解反应液A液；

（5）向所述多孔紫外微孔板的各孔分别加入枸橼酸标准品和一个以上的待测样品，反应一段时间后，置于酶标仪上在特定紫外波长下读取各枸橼酸标准品微孔的吸光度值A_STD1、以及待测样品微孔的吸光度值A_SP1；

（6）在所述多孔紫外微孔板的各孔中再加入酶解反应液B液，反应一段时间后，置于酶标仪上在所述特定紫外波长下读取各枸橼酸标准品微孔的吸光度值A_STD2、以及待测样品微孔的吸光度值A_SP2；

（7）将各枸橼酸标准品微孔的A_STD1和A_STD2的差值ΔA与各枸橼酸标准品的浓度进行回归拟合来构建标准曲线；

（8）将A_SP1和A_SP2的差值插入所述标准曲线，得到对应的浓度，即可得到待测样品的枸橼酸含量。

2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤（1）中，配制浓度范围为50000～1000ng/mL的枸橼酸标准品5个以上，优选地，配制浓度分别为40300、32240、24180、16120、8060、4030、2015、1007.5ng/mL的枸橼酸标准品以构建定量用标准曲线。

3.根据权利要求1或2所述的测定方法，其特征在于，

待测溶液是尿液、果汁、酒、固体食品的溶液中的任意一种，优选地，所述待测溶液是尿液，所述待测样品是将待测尿液用水稀释而得，优选地，至少稀释10倍；

待测溶液的枸橼酸含量由步骤（8）中所得的浓度乘以稀释倍数而得。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤（2）中，酶解反应液A液中，溶剂为甘氨酰甘氨酸缓冲液，L-苹果酸脱氢酶的浓度为10～15U/mL，L-乳酸脱氢酶的浓度为20～30 U/mL，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的浓度为0.3～0.6g/L。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤（3）中，酶解反应液B液中，溶剂为水，优选为双蒸水，枸橼酸裂解酶的浓度为30～50U/mL。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的测定方法，其特征在于，

所述多孔紫外微孔板是96孔紫外微孔板，

步骤（4）中，酶解反应液A液的用量为100微升/孔以下；

步骤（5）中，枸橼酸标准品和/或待测样品的用量为200微升/孔以下；

步骤（6）中，酶解反应液B液的用量为2微升/孔以下。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤（5）中，待测样品的数量为30个以上。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的测定方法，其特征在于，所述特定紫外波长为320～360nm，优选为340nm。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤（5）和/或步骤（6）中，反应时间为5分钟以上。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的测定方法，其特征在于，步骤（7）和步骤（8）采用微孔板数据采集和分析软件进行，所述软件优选为SoftMax软件。