[发明专利]一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用。本发明根据毕赤酵母密码子的偏好性，对枯草芽孢杆菌的壳聚糖酶编码基因进行了优化，优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步利用毕赤酵母表达系统对该所述优化的壳聚糖酶编码基因进行高效分泌表达，获得枯草芽孢杆菌壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明获得的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶对不同脱乙酰度的壳聚糖底物均有较高的水解活性，摇瓶发酵产生的粗酶液即具有1mL(蛋白含量0.3mg)降解5g壳聚糖的水解能力，而降解相同量的壳聚糖约需要非特异性商品酶150mg，理论上效率提高500倍；具有良好的工业应用前景。

技术领域

本发明属于壳聚糖酶技术领域，具体涉及一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用。

背景技术

壳聚糖酶(Chitosanases，EC.3.2.1.132)广泛存在于古菌、细菌及真核生物中，在糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases，GH)家族3、5、7、8、46、75及80中均有分布，其中，家族46、75及80中仅包含壳聚糖酶。在工业上，由于缺乏经济高效的特异性壳聚糖酶，往往使用蛋白酶及纤维素酶等非特异性商品酶类水解壳聚糖以制备壳寡糖。由于具有壳聚糖酶水解活性的酶类在这些商品酶中所占比例极低，用酶量较大，壳寡糖的生产成本也相应增加。因此，迫切需要研发出一系列经济高效的壳聚糖酶以满足工业壳寡糖生产的需求。

本发明研发人员前期在多种食品级商品酶中筛选具有壳聚糖水解酶活性的酶制剂时发现，使用枯草芽孢杆菌发酵生产的淀粉酶及中性蛋白酶均具有较好的壳聚糖水解活性(1g粗酶干粉约可彻底水解30g壳聚糖)，提示这些商品酶的来源菌株枯草芽孢杆菌中具有壳聚糖酶编码基因。我们通过基因组检索发现，枯草芽孢杆菌中存在壳聚糖酶的编码基因。为获得更安全高效的壳聚糖酶，我们对该基因进行了密码子优化并在毕赤酵母中进行分泌表达。表达的壳聚糖酶能够替代现有的商品酶用于壳寡糖的规模生产。

发明内容

本发明的目的是，提供一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶及其制备方法和应用；旨在提供一种经济高效的特异性壳聚糖酶。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：

本发明通过对枯草芽孢杆菌壳聚糖酶编码基因的密码子进行优化，以利于其在毕赤酵母中实现分泌表达，从而高效快速的获得水解活性高的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶。

本发明提供的一种枯草芽孢杆菌壳聚糖酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的制备方法为：将核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示的壳聚糖酶基因构建至表达载体中，然后导入毕赤酵母细胞，诱导并获得分泌表达的壳聚糖酶。

所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶的具体制备步骤包括：(1)根据毕赤酵母密码子使用的偏好性，对来源于枯草芽孢肝菌的壳聚糖酶基因原始序列进行密码子优化；(2)将优化后的基因进行全合成并构建至表达载体pGBG1中；(3)对构建的表达载体进行酶切线性化后，舍弃含有抗性基因的片段，回收含有壳聚糖酶基因的片段并导入毕赤酵母细胞GS115中，诱导并获得分泌表达的壳聚糖酶；(4)利用诱导表达的壳聚糖粗酶上清对壳聚糖底物进行水解并使用高效液相色谱方法对产物的聚合度进行分析。本发明所述的枯草芽孢杆菌壳聚糖酶可单独用于壳聚糖的降解制备壳寡糖；或者所述枯草芽孢杆菌壳聚糖酶与其他壳聚糖酶或几丁质酶混合使用，协同降解壳聚糖或几丁质。

所述表达载体pGBG1的获得方式是：通过对表达载体pPIC9中的信号肽序列(详见SEQ ID NO.4所示)进行密码子优化，获得适合在毕赤酵母中表达的新的信号肽序列(详见SEQ ID NO.5所示)，并利用Nsi I/Xho I双酶切将SEQ ID NO.5所示的信号肽序列替代原先的SEQ ID NO.4所示信号肽，得到表达载体pGBG1。该表达载体pGBG1能够使目的蛋白在毕赤酵母中更高效的分泌表达。