[发明专利]修饰植物基因组的方法和手段

权利要求书

1.用于在预定位点修饰植物细胞的基因组的方法，其包括以下步骤：

a.在所述预定位点附近或在所述预定位点上诱导双链DNA断裂，所述双链断裂由向所述细胞中引入识别所述预定位点附近或所述预定位点上的识别序列的双链DNA断裂诱导(DSBI)酶来诱导；

b.选择植物细胞，其中已经修复了所述双链DNA断裂，导致基因组中在所述预选位点处的修饰，其中所述修饰选自

i.至少一个核苷酸的替换；

ii.至少一个核苷酸的缺失；

iii.至少一个核苷酸的插入；或

iv.i.–iii.的任一组合；

其特征在于所述预定位点紧靠现有的原种事件。

2.权利要求1的方法，其中所述预定位点位于所述原种事件的1cM内。

3.权利要求1或2的方法，其中所述预定位点位于所述原种事件的100kb内。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述预定位点和/或识别位点位于所述原种事件的侧翼序列之一内。

5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述原种事件是包含在植物基因组内包含的外源DNA的遗传基因座，所述外源DNA已经被选择以符合一个或多个以下标：

a)外源DNA的存在不损害植物的其他所期望的特性，如与农艺学性能或商业价值相关的那些特性；

b)事件的特征在于充分定义的稳定遗传的分子构型，且为其可开发用于鉴定对照的适当工具；

c)在事件的杂合(或半合子)和纯合状态下，目的基因在一系列的环境条件下以商业可接受水平显示正确、适当且稳定的空间和时间表型表达，在所述环境条件中携带所述事件的植物可能处于正常的农艺学用途。

d)外源DNA与植物基因组中允许容易渐渗入所需商业遗传背景的位置相关。

6.权利要求1－5任一项的方法，其中所述原种事件选自第78段或表1。

7.权利要求1－6任一项的方法，其中所述DSBI酶是非天然存在的。

8.权利要求1－7任一项的方法，其中所述识别序列包含在SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4中。

9.权利要求1－8任一项的方法，其中所述识别序列包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的核苷酸序列。

10.权利要求1-9任何一项的方法，其中所述DSBI酶是单链大范围核酸酶或一对大范围核酸酶，其识别或一致识别所述预定位点并诱导所述双链断裂。

11.权利要求10的方法，其中所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对来自I-CreI，并且其中以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元1中：

a.位置32处的S；

b.位置33处的Y；

c.位置38处的Q；

d.位置80处的Q；

e.位置40处的S；

f.位置42处的T；

g.位置77处的R；

h.位置68处的Y；

i.位置70处的Q；

j.位置75处的H；

k.位置44处的T；

l.位置24处的I；

m.位置26处的Q；

n.位置28处的K；

o.位置30处的N，

并且其中以下氨基酸存在于大范围核酸酶单元2中：

p.位置70处的S；

q.位置44处的Q；

r.位置24处的K；

s.位置26处的A；

t.位置28处的K；

u.位置30处的N；

v.位置32处的S；

w.位置33处的Y；

x.位置38处的Q；

y.位置80处的Q；

z.位置40处的S；

aa.位置42处的T；

bb.位置77处的Q；

cc.位置68处的Y。

12.权利要求10或11的方法，其中所述大范围核酸酶或大范围核酸酶对包含SEQ ID NO.6从氨基酸位置11-165和位置204-360的氨基酸序列。

13.权利要求1-12任一项的方法，其中在步骤b.之前，向所述细胞中递送修复DNA分子，所述修复DNA分子用作修复所述双链DNA断裂的模板。