[发明专利]在细胞培养物中生产重组高分子量vWF的方法

权利要求书

1.一种包含重组Von Willebrand因子(rVWF)的细胞培养物上清液，其中至少20％的rVWF是以超过10个二聚体的高分子量VWF多聚体的形式存在，所述细胞培养物上清液经补充以提供2.4μg/L至20μg/L之间的最终铜浓度，所述细胞培养物上清液中的NH₄⁺含量维持在低于4mM的浓度，并且在细胞培养期间细胞密度维持在小于2.5×10⁶个细胞/mL。

2.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液每mL含有至少0.5IU利托菌素辅因子活性。

3.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少30mU/μg rVWF。

4.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少40mU/μg rVWF。

5.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少50mU/μg rVWF。

6.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少60mU/μg rVWF。

7.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少70mU/μg rVWF。

8.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少80mU/μg rVWF。

9.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液中至少30％的rVWF是以超过10个二聚体的高分子量VWF多聚体的形式存在。

10.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述rVWF是以14至22个二聚体的高分子量VWF多聚体的形式存在。

11.根据权利要求1所述的细胞培养物上清液，其中所述上清液进一步包含重组因子VIII(rFVIII)。

12.根据权利要求11所述的细胞培养物上清液，其中rVWF与rFVIII之比是至少10:1。

13.一种用于生产重组Von Willebrand因子(rVWF)蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：

(a)提供基础细胞培养基；

(b)给所述基础细胞培养基补充铜，以提供2.4μg/L至20μg/L之间的最终铜浓度；

(c)提供一个或多个细胞，所述一个或多个细胞包含编码rVWF蛋白的核酸；

(d)在补充了铜的细胞培养基中连续培养所述一个或多个细胞，使得细胞表达rVWF并将其分泌进培养物上清液中，所述细胞培养物上清液中NH₄⁺含量维持在低于4mM的浓度，所述NH₄⁺含量在所述一个或多个细胞的连续培养中维持至少7天，并且在培养所述一个或多个细胞的步骤过程中将细胞密度维持在小于2.5×10⁶个细胞/mL；和

(e)回收所述培养物上清液的至少一部分，

其中所述回收的上清液的rVWF的利托菌素辅因子比活性为至少30mU/μg rVWF。

14.根据权利要求13所述的方法，其另外包括下述步骤：在培养所述一个或多个细胞之前，用水解物补充所述基础细胞培养基。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述水解物是植物水解物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述水解物是大豆水解物。

17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是不含动物蛋白的培养基。

18.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是不含蛋白的培养基。

19.根据权利要求13至18中任一项所述的方法，其中所述基础细胞培养基是化学成分确定的培养基。