[发明专利]不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法

说明书

本发明公开了一种不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法，采用标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾混精杂交相结合的方法进行转基因家蚕纯合品系的筛选。该法无须任何的分子生物学实验，操作技术要求低，可快捷、高效的筛选出双亲均为转基因纯合子的后代进行留种继代，保证外源基因在宿主基因组上的纯合性，缩短了获得基因型纯合的转基因家蚕所需的时间与成本，而且单拷贝和多拷贝整合的转基因家蚕品种均适用，可广泛应用于转基因家蚕遗传分析及品种培育研究，为该转基因家蚕品种的研究与开发奠定坚实基础。

技术领域

本发明属于转基因家蚕技术领域，尤其涉及一种不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法。

背景技术

家蚕自野蚕经人工选择和驯化而来，与野蚕祖先相比，家蚕的产丝性能提高近10倍。1930年代开始利用一代杂种优势，蚕丝产量比饲养纯种又提高了近20％。自此，家蚕生产能力达到了一个难以逾越的高峰，使得其后近80年间未见革命性突破。转基因育种技术由于具有育种周期短、目的性强、可突破不同物种间基因难以重组的难题等优点，具有传统育种所无法比拟的优越性。目前，转基因家蚕的获得主要是通过piggyBac转座子介导实现外源基因的插入与表达，该转座子在家蚕基因组上的插入具有一定的随机性，整合可能位于一条染色体上，也可能位于多条染色体上，即形成整合位点的纯合子、杂合子和多重杂合子。而基因型的纯合是对生物材料进行遗传分析的基础，也是保证后代性状不发生分离的基础，所以从诸多携带同一外源基因的转基因家蚕个体或后代中筛选出外源基因在两条同源染色体上均有整合(即纯合子)的个体，是对该转基因家蚕品种进行后期的遗传分析与品种选育开发的基础。

获得转基因生物纯合体(或纯合系)的方法多种多样，这主要根据前期转基因方法的不同而确定，主要有通过测交结合设计特异PCR引物进行扩增筛选获得、旁侧PCR方法筛选获得等。而挑选家蚕某个性状基因型的纯合与否，传统方法主要是采用半分法：将一个蛾产下的卵分成两部分，一部分暂时冷藏保留，另一部分进行饲养后每一个蛾与无检测性状的纯合蚕品种杂交；然后饲养杂交F1代所有个体，检测相关性状是否分离，由此结果推断亲本的纯合性；如果F1代检测的性状不分离，则其亲本为纯合子，冷藏的另一半蚕种可作为该性状的纯合系进行保留。使用上述方法进行转基因家蚕纯合品系的筛选与培育存在以下一些问题：(1)其他物种的转基因纯合系筛选方法不能完全适用于转基因家蚕纯合子筛选；(2)技术要求高，费时、费力又需要消耗大量资金。(3)半分法筛选概率不确定，需要饲养大量的蚕区、并制备大量的蚕种，太耗人力物力；而且在养蚕过程中丢失小蚕难以避免，因人为操作问题，可能淘汰掉一些无检测性状出现的蚕体，造成假阳性结果。

在前期研究中，申请人建立了一种一种单拷贝转基因家蚕品系的纯合方法(申请号2016109384966申请日2016年10月25日)：该法利用测交并结合整合位点5′上游和3′下游侧翼序列特异性引物与外源基因特异性引物的组合，进行旁侧PCR，通过与野生型基因组的结果比较，能够方便的区分整合位点纯合子及杂合子，进而成功挑选出纯合子进行留种继代。但使用该法的前提是要测试出外源基因插入到染色上的旁侧序列，且适用于单拷贝插入的情况，无法应用到多个位点多拷贝插入的情况。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种技术要求低、时间短、成本低的不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法，为转基因家蚕遗传研究和培育综合经济性状优良的转基因家蚕品种奠定坚实的基础。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法，采用标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾混精杂交相结合的方法进行转基因家蚕纯合品系的筛选。