[发明专利]不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法

权利要求书

1.一种不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法，其特征在于：采用标记基因筛选、雄蛾测交、雌蛾混精杂交相结合的方法进行转基因家蚕纯合品系的筛选；具体是将来自姬蚕或普通斑的转基因品种内自交后，对应的雌蛾再与虎斑的雄蛾杂交，后代将出现姬蚕或普通斑和虎斑，再将该F1代的虎斑进行转基因标记基因检测，如果全部为转基因个体，说明该杂交方式中的雌蛾为整合位点纯合子；如果出现非转基因个体，则说明该杂交方式中的雌蛾为整合位点杂合子；而杂交方式中转基因♂的整合位点纯合性，通过测交验证；所述转基因家蚕为KAP3.2-R转基因家蚕或932×KAP4.3黄茧转基因家蚕。

2.根据权利要求1所述的不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法，其特征在于按以下步骤操作进行：

1饲养转同一个表达载体的转基因家蚕到化蛾，选取雌蛾与雄蛾交配2小时后拆对；将该雄蛾与非转基因家蚕品种的雌蛾杂交，该雌蛾产的卵编号为1；而刚刚自交交配完的转基因雌蛾再与虎斑品种的雄蛾杂交，交配后该雌蛾产的卵编号为3；

2第二天收集所产的卵，进行即时浸酸催青，让其发育；

3催青后期，蚕种转青后，按转基因载体设计的荧光标记，进行相应筛选标记的检测；

4转基因品系雄蛾测交所产的卵，通过检测荧光标记基因的表达情况，标记并淘汰整个蛾圈内有不表达个体出现的蛾圈；有不表达个体出现的蛾圈对应雄蛾交配后所产的卵也一并标注出来进行淘汰；

5检测完编号为1的蛾圈后，对保留下来编号为3的蛾圈进行荧光标记检测，保留整个蛾圈内所有个体均有表达的蛾圈，淘汰有不表达个体出现的蛾圈；

6饲养经过上述荧光标记检测后筛选留下的蛾圈和对应的虎斑测交蛾圈；单蛾区饲养方式饲养，四龄起蚕第二餐，调查蚕体斑纹；对应虎斑测交后代全为虎斑，与其同一父本的混精杂交后代如果出现虎斑和姬蚕或普通斑，则对该混精杂交后所产蛾圈内的虎斑进行荧光标记检测，如果所检测的个体均有荧光，表明该父母本均为转基因整合位点纯合子；保留该纯合子后代中的姬蚕或普通斑，并留种继代，即为转基因纯合品系。

3.根据权利要求2所述的不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法，其特征在于还包括步骤7分析后代是否分离，验证选出的纯合品系，具体按以下操作进行：催青选出的纯合系蚕卵至转青，调查标记基因表达情况，一个蛾圈内所有个体均有表达；继续饲养该蛾圈的所有个体至化蛾，自交14蛾留种，剩下的蛾与常规非转基因蚕品种进行杂交并制种，让这些种孵化至转青，调查标记基因表达情况，所有自交和杂交的蚕卵均为阳性。

4.根据权利要求3所述的不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法，其特征在于：步骤1中所述转基因家蚕饲养200头以上。

5.根据权利要求3所述的不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法，其特征在于：步骤1中对虎斑雄蛾进行测交验证其纯合性。

6.根据权利要求3所述的不同斑纹品种混精杂交筛选转基因家蚕纯合子的方法，其特征在于：步骤1中每一组交配方式均制备25个蛾圈以上的卵。