[发明专利]一种检测硫化氢高选择性反应型荧光探针的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测硫化氢高选择性反应型荧光探针的应用，其属于精细化工领域。

背景技术

硫化氢（H₂S）是一种具有臭鸡蛋气味的无色气体，对呼吸道、神经系统及眼部都有刺激作用，过量吸入会致使人产生呼吸衰竭、意识模糊等症状，严重者甚至可能导致死亡。同时，H₂S也是人们发现的“第三种”生物内源性气体信使分子（其他两种分别为CO和NO），在生理及病理过程中发挥了极其重要的作用，对心血管系统、神经系统、呼吸系统以及内分泌系统的调节意义重大。

目前，常见的H₂S检测方法有：比色法，电化学法，气相色谱法以及极谱法等。然而上述方法都存在着一些不足，比如检测标样的预处理过程较为复杂且通常会对样品造成破坏，使得这些方法无法用于H₂S在生物体内的检测，这就极大的限制了上述这些检测方法的实际应用。而利用荧光分子探针对体外及生物体内的H₂S进行定量检测的方法，具有高选择性、高灵敏度、操作便捷性及样品非破坏性等优点。因此，开发性能优良的荧光探针是十分有必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够兼具体外环境和活体细胞内的硫化氢检测的高选择性反应型荧光探针及其应用，该化合物及硫解扣环产物的荧光属性具有明显差异。利用该探针反应可对体外环境和活体细胞中硫化氢进行定量检测。探针2-{(6-(二甲氨基)-3-(2,4-二硝基苯氧基)萘乙酰胺-2-)亚甲基}丙二腈的应用，其与硫化氢发生亲核硫解反应并扣环后可生成具有荧光发射性质的产物，以达到在能在温和条件下、高选择性的、易检测产物的目的。

本发明采用的技术方案为：一种检测硫化氢高选择性反应型荧光探针的应用，该该荧光探针为2-{(6-(二甲氨基)-3-(2,4-二硝基苯氧基)萘乙酰胺-2-)亚甲基}丙二腈，其结构式如式（1）所示：

式（1）

该荧光探针的2,4-二硝基苯醚基团与硫化氢发生亲核硫解反应并扣环，反应产物为一种香豆素衍生物并能产生荧光，通过定量检测反应产物的荧光来测定不同样品中硫化氢的含量。

测定硫化氢含量的步骤包括：

（1）将探针加入体积比为乙腈：PBS=9:1的混合溶剂中，所述探针的浓度为5~50μmol/L；

（2）将待测样品加入上述探针溶液中进行反应，得到反应后待测样品；反应体系的pH为5.5-10.5，反应体系的温度为20- 60 ^oC；

（3）激发波长550 ~ 600 nm，在600~ 650 nm进行荧光发射谱的检测，得到反应后待测样品的荧光强度；

（4）将待测物质荧光强度代入线性曲线方程，得到待测样品中硫化氢的浓度；所述线性曲线方程为Y = 4.807 * X -11.37，相关系数R² = 0.993，其中Y为625 nm处反应后待测样品的荧光强度，X为硫化氢浓度。

所述探针应用于体外环境中的硫化氢含量或在活体细胞中进行硫化氢含量检测。

所述亲核硫解反应体系pH介于5.5~10.5之间；探针的浓度介于5~50μmol/L之间；体系反应温度介于20~ 60 ^oC之间。

该探针不具备荧光而其反应产物具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测。

一种可在体外环境和活体细胞中检测硫化氢的高选择性反应型荧光探针及其应用，该探针上的2,4-二硝基苯醚（DNP）基团可在体外环境及Hela细胞（人宫颈癌细胞）中与硫化氢发生亲核硫解反应，水解扣环形成一种香豆素衍生物，该产物具有荧光；该探针是以2,7-二羟基萘为原料，经四步反应合成得到。

式（1）

本发明还提供了该探针的应用，该探针可以与硫化氢发生亲核反应，水解扣环后，通过定量检测π-延伸香豆素衍生物的生成量来检测乙腈-PBS体系中及细胞中的硫化氢含量，具体测定方法为：

选择乙腈：PBS（9:1，v:v，25mM）作为体外测试体系，反应温度为25^oC至40^oC之间，优选反应温度为37^oC，反应pH为7.4；细胞内孵育温度为为37^oC，孵育pH为7.4。

反应时间为2-60min，当硫解环化反应完全，荧光强度不再变化，进行测定。