[发明专利]一种提高超声破碎大肠杆菌效率的悬浮液及方法

说明书

技术领域

本发明属于大肠杆菌提取技术领域，尤其涉及一种提高超声破碎大肠杆菌效率的悬浮液及方法。

背景技术

大肠杆菌是基因工程中最常用的一种原核微生物，由于其遗传背景清楚，易于培养，生长迅速而倍受生物、基因工程专家的青睐，常被作为外源基因表达的宿主，也是目前应用最广泛，表达最成功的体系。已使用其成功表达重组胰岛素、干扰素、白介素以及表皮生长因子等多种极具医药价值的活性蛋白质产品。由于很多重组基因表达的蛋白质产物都存在于大肠杆菌细胞内部，所以必须对大肠杆菌细胞进行破壁后使这些重组蛋白释放出来，再进行后续的分离纯化，最后获取所需的目的蛋白。因此，在整个过程中，如何简便高效的破碎大肠杆菌细胞成为提取重组蛋白质产物的关键性步骤。

大肠杆菌是一种革兰阴性菌，其细胞壁的内层为肽聚糖层，最外层为脂多糖层，这一结构使大肠杆菌具备较强的抗拉伸和抗剪切能力。目前常用的破碎方法主要有非机械法和机械法两大类。非机械法包括酶法、化学渗透法、渗透压法和冻融法。酶法由于溶菌酶和蛋白酶抑制剂价格十分昂贵，同时溶菌酶自身也影响后续重组蛋白质的分离，限制了该法的应用；使用化学渗透法、渗透压法和冻融法破碎大肠杆菌，操作过程繁琐、耗时，且破碎效率低，重组蛋白获得率低下，只适用于分离一些小分子量的产物。因此，较少使用非机械法破碎大肠杆菌。目前，实验室通常采用机械法超声波破碎，首先将菌体悬浮于PBS液中，再放置于超声破碎仪中进行破碎，PBS液在超声破碎过程中仅起到平衡渗透压、维持离子强度和pH的作用，对溶解其中的蛋白保护性较弱，而在超声破碎的过程中会产生大量的热量，所以使用PBS液悬浮菌体进行超声破碎易使蛋白活性降低，破坏蛋白结构，造成蛋白量的损失。因此，开发一种能够提高大肠杆菌破碎的效率，同时减少蛋白损失的悬浮体系，对提取大肠杆菌中的重组蛋白具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种提高超声破碎大肠杆菌效率的悬浮液及方法。本发明提供的新悬浮液可有效提高超声破碎大肠杆菌的效率，显著提高了大肠杆菌中重组蛋白的获得率和蛋白纯度。

本发明第一方面，提供一种提高超声破碎大肠杆菌效率的悬浮液，所述悬浮液包括以下浓度的组分：0.8～1.2M的Tris-HCl，3～7M的NaCl，0.3～1M的EDTA(乙二胺四乙酸)，0.05～0.2M的DTT(二硫苏糖醇)+15～25wt％的蔗糖和0.08～0.15v/v％的TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)，pH为7.1～8.0。

作为优选，所述悬浮液包括以下浓度的成分：1MTris-HCl+5M NaCl+0.5M EDTA+0.1MDTT+20wt％蔗糖+0.1v/v％TritonX-100+dH₂O。

作为优选，所述悬浮液的pH为7.5～7.6。

本发明第二方面，还提供一种提高超声破碎大肠杆菌效率的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤(1)室温下将大肠杆菌菌液离心，收取大肠杆菌菌体，将菌体与悬浮液混匀，在冰浴中进行超声破碎；

步骤(2)将破碎后的菌液分装，离心，合并上清液，使用滤菌器将上清液进行过滤，收集滤液。

进一步地，步骤(1)超声条件为：功率90W，超声10～15s，停顿20～25s，超声总时间为20～30min。

进一步地，所述菌体与悬浮液的质量体积比为1：10～15。