[发明专利]一种莲藕褐变相关基因的瞬时表达方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，更具体地，涉及一种莲藕褐变相关基因的瞬时表达方法和应用。

背景技术

鲜切果蔬因其新鲜、营养、方便等特点，逐渐成为果蔬采后研究新领域。目前鲜切加工的果蔬很多，有苹果、哈密瓜、菠萝、马铃薯、甘蓝、山药、生菜、黄瓜等。莲藕(Nelumbo nucifera G.)为睡莲科莲属，是我国产量最高、种植面积最大的水生蔬菜。莲藕富含多种营养成分，且据古籍记载具较高的药用价值。随着鲜切果蔬的引入，近年来鲜切莲藕倍受消费者青睐。然而莲藕鲜切制品在加工及贮藏过程中易发生伤呼吸、褐变及微生物污染等，其中以组织褐变尤为严重。褐变积累的褐色或黑色物质直接影响其感官性状和内在品质，大大降低莲藕的商品价值，因此褐变成为莲藕产业的瓶颈之一。

鲜切果蔬褐变起主要作用的是酶促褐变，前人针对酶促褐变机理已作大量研究，普遍认为PAL、PPO和POD是参与果蔬酶促褐变的三个关键基因。然而目前鲜切莲藕褐变机制研究主要涉及生理生化，研究表明PAL、PPO和POD可能在其褐变中起着重要作用。但莲藕褐变分子机制则鲜见报道，只有少量PPO基因的克隆与表达分析，至今有关PAL、PPO和POD作为鲜切莲藕褐变直接靶基因的推测仍无直接证据。

现有技术中研究褐变基因通常要提取莲藕中的总RNA，然后通过RT-PCR对目的基因进行表达模式分析，该方法只能初步筛选参与莲藕褐变的候选基因。而基因功能验证一般是通过转基因实现，转基因的方法周期长，且复杂。

发明内容

本发明的目的是提供一种莲藕褐变相关基因的瞬时表达方法，该方法可以方便快捷地用于莲藕褐变相关基因的确认和调控研究。

为了实现上述目的，本发明提供一种莲藕褐变相关基因的瞬时表达方法，该方法包括以下步骤：

(1)将带有目的基因的表达载体质粒电导转化至农杆菌中，平板培养，并将培养物与注射液混合，得到目的基因的农杆菌培养液；

(2)选择无机械损伤的新鲜莲藕，莲藕去泥、洗净、去皮、切片，分别注射带有对照基因和目的基因的农杆菌培养液；然后，将注射后的莲藕切片样品进行褐变实验，定期液氮速冻取样，对样品进行褐变度测定，从而分析目的基因在莲藕切片中瞬时表达的效应。

具体地，步骤(1)包括：将带有目的基因的表达载体质粒电导转化至农杆菌中，制成甘油菌，零下80℃保存，将保存的甘油菌接种至LB平板，25-30℃培养2天，实验的前一天，再转移至新的LB平板培养，将LB平板上的农杆菌与注射液体均匀混合，得到目的基因的农杆菌培养液。

本发明中，所述注射液优选为5-20mM MgCl₂和0.2-0.8mM乙酰丁香酮的二甲基亚砜(DMSO)溶液，最优选为10mM MgCl₂和0.5mM乙酰丁香酮的DMSO溶液。

根据本发明，所述褐变实验优选在20-25℃下进行。

根据本发明，该方法还包括目的基因的克隆与表达载体的构建。所述目的基因的克隆与表达载体的构建均可通过本领域各种常规方法实现。

本发明的方法中，所述目的基因可以为NnPAL1基因(SEQ ID NO：7)、NnPPOA基因(SEQ ID NO：8)和NnPOD3基因(SEQ ID NO：9)中的至少一者。

此时，NnPAL1基因的全长序列优选通过引物SEQ ID NO：1和引物SEQ ID NO：2获得；NnPPOA基因的全长序列优选通过引物SEQ ID NO：3和引物SEQ ID NO：4获得；NnPOD3基因的全长序列优选通过引物SEQ ID NO：5和引物SEQ ID NO：6获得。上述引物设计均包含起始密码子和中止密码子。

本发明中，所述对照基因优选为SK基因。

本发明的瞬时表达方法可用于莲藕褐变相关基因的确认和调控研究。

本发明利用莲藕切片瞬时表达方法，通过莲藕褐变基因的全长序列的获得，以及其在不同温度贮藏下的基因表达分析，表达载体构建，农杆菌转化，验证了基因功能。本发明方法分析莲藕褐变基因在莲藕贮藏过程的表达模式，最后通过莲藕切片的瞬时表达验证目的基因的功能。这从分子机制上阐明了莲藕褐变调控机制，有利用进一步开展莲藕褐变功能验证(转基因，基因互作等)研究。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显，其中，在本发明示例性实施方式中，相同的参考标号通常代表相同部件。

图1示出了不同温度贮藏对莲藕褐变的影响。