[发明专利]免药物筛选快速获得小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的方法

权利要求书

1.一种免药物筛选快速获得小鼠Rosa26基因定点整合外源基因的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)选择小鼠Rosa26基因打靶位点；

2)设计靶向Rosa26的gRNA；

3)构建CRISPR/Cas9表达质粒pX458-Rosa26；

4)构建无启动子的带红色荧光报告基因的同源重组供体载体；

5)细胞转染：将所述CRISPR/Cas9表达质粒pX458-Rosa26与所述同源重组供体载体共转染进入小鼠ES细胞；

6)用流式细胞技术先通过绿色荧光分选出成功转染质粒的细胞进行培养7天后，通过红色荧光进行单细胞分选，经培养获得定点整合外源基因的ES单克隆细胞系；

所述CRISPR/Cas9表达质粒的gRNA的Oligo序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述步骤3)中，将两条Oligo混合并稀释至10μM，退火并复性使形成双链结构；退火程序为37℃，30分钟；95℃，5分钟；-5℃/min降至20℃；然后将退火后的双链以1：200比例稀释后，取1μL，加入100ng的pX458空载体；再加入Bbs I酶使所述pX458空载体线性化并加入T4连接酶使带有粘性末端的双链与所述pX458空载体连接，得到pX458-Rosa26质粒；

所述步骤3)还包括将连接好的所述pX458-Rosa26质粒转入DH5α感受态中，涂板，扩大培养；

所述步骤5)的细胞转染条件为：待细胞生长至培养皿90％体积时，弃掉培养基，用PBS洗两次，胰酶消化1min，加入适量血清终止反应；将细胞吹打悬浮，200g离心4min，弃上清，用PBS重悬，轻轻吹打混匀；再次离心并弃上清；每1×10⁶个细胞加入5μg pX458-Rosa26质粒并用100μL电极缓冲液重悬；室温孵育5分钟后用1400V、20ms电击2次，然后迅速加入预先放置含20％胎牛血清的DMEM的六孔板中培养；将构建好的pX458-Rosa26质粒与所述同源重组供体载体共转入ES细胞，24h后换液；

所述外源基因为外源Tyr基因及DsRed报告基因；

所述同源重组供体载体为Tyr-2A-DsRed，其包含位于两端的同源臂，以及位于同源臂中间的外源插入序列，所述外源插入序列包括Tyr基因序列与红色荧光报告基因DsRed序列，以及剪接受体位点SA；

所述步骤5)还包括：细胞转染后3d，弃培养基并用PBS洗两次，胰酶消化并200g离心4min，弃上清，PBS洗涤一次，用600μL PBS重悬，经孔径为40μm的细胞网筛筛入流式管中，先后进行绿色荧光和红色荧光的双重荧光筛选。