[发明专利]重组Wzt蛋白兔血清多克隆抗体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种重组Wzt蛋白兔血清多克隆抗体及其制备方法。

背景技术

布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)由布鲁氏菌(Brucella)引起，主要感染反刍动物和人类，也可感染鹿、犬类等，全球大部分地区均有布鲁氏菌病感染的报道。

动物患布病会引起怀孕动物流产，产奶量下降和不育等一系列问题，对经济影响非常大，特别是在发展中国家。绝大多数布鲁氏菌都可以感染人，并引起严重的疾病，不仅需要配合抗生素的治疗，而且治疗时间相对较长，遗留下来的后遗症通常相对严重。布病的传播使得畜牧业的发展和人类健康受到严重影响，全世界每年新发感染人数大约为50万人，在世界二百多个国家和地区中报告有人畜疫情的国家有170多个，因此，在布病流行的国家，消除布病一直是人们一直以来都想要实现的目标。致病机理(包括胞内寄生机理)以及免疫机理尚不十分清楚是布鲁氏菌病研究过程中的一个瓶颈，导致其防控存在一定的难度。

脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)广泛存在于革兰氏阴性细菌中，对于革兰氏阴性细菌外膜的结构和功能完整性至关重要，可以引起哺乳动物免疫反应。布鲁氏菌的LPS是其主要的毒力因子。目前，布鲁氏菌LPS合成的途径并不完全清晰，已经发现的与布鲁氏菌LPS合成相关的主要基因编码产物有过骨胺合成酶(per)、磷酸甘露糖变位酶(Pmm或maB)、甘露糖基转移酶2(wbkA，wbdA，BadC)、磷酸葡萄糖变位酶(pgm)和转运载体(wzt和wzm)。其中wzt基因是布鲁氏菌LPS合成中的关键基因，与wzm等基因共同组成布鲁氏菌ABC转运系统。ABC转运系统是细菌中由一系列同源基因编码的操纵子组成的细胞转运机器，所说的操纵子由ATP结合蛋白、膜蛋白、亚基结合蛋白三部分构成。ABC转运系统参与胞外多糖的合成，并且能够运输膜外生物大分子。此外，ABC转运系统在细菌营养成分的运输、毒力分子的外排等过程中也起着至关重要的作用。然而ABC转运系统对细菌毒力、免疫原性及蛋白质表达的影响尚不清楚。

GenBank中记录的wzt基因的功能为水解ATP释放出能量，同时将OPS侧链转移到外膜上进而形成光滑型LPS。研究发现，wzt基因的缺失会造成LPS的合成受阻，但其性质及如何参与LPS合成的机制尚未见报道。

发明内容

为了填补应用重组Wzt蛋白制备特异性多克隆抗体的空白，本发明提供一种重组Wzt蛋白兔血清多克隆抗体及其制备方法。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的重组Wzt蛋白兔血清多克隆抗体，它是利用重组Wzt蛋白作为抗原，对雌性家兔进行四次免疫后再经纯化处理后获得的。

本发明还提供了上述重组Wzt蛋白兔血清多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、初次免疫

将500μg重组Wzt蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合乳化后，在雌性家兔背部进行皮下多点注射，每点100μg重组Wzt蛋白；

步骤二、二次免疫

在初次免疫的一周后进行二次免疫，将400μg重组Wzt蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后，在雌性家兔背部进行皮下多点注射，每点80μg重组Wzt蛋白；

步骤三、三次免疫

在二次免疫的一周后进行二次免疫，将400μg重组Wzt蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后，在雌性家兔背部进行皮下多点注射，每点80μg重组Wzt蛋白；

步骤四、四次免疫

在三次免疫的一周后进行二次免疫，将400μg重组Wzt蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合乳化后，在雌性家兔背部进行皮下多点注射，每点80μg重组Wzt蛋白；

步骤五、每次免疫后采集雌性家兔耳静脉血，以未进行免疫时的兔血清为对照、纯化后重组Wzt蛋白为抗原，应用间接ELISA法检测兔血清抗体效价，血清稀释倍数分别为100、200、400、1600、3200、6400；

步骤六、第四次免疫一周后，采集兔全血，将收集的兔全血在37℃静置2h，4℃静置过夜，次日4000rpm、离心10min收集上清，得到兔血清；

步骤七、纯化

(1)将上述所得兔血清与等体积的抗体结合缓冲液混合后过滤；

(2)用10倍柱体积的抗体结合缓冲液平衡ProteinA柱子，将上述过滤后的兔血清打入到柱子中；

(3)用抗体结合缓冲液清洗柱子，洗脱杂蛋白，直至流出的下液中不含有蛋白成分；