[发明专利]PDE‑5抑制剂胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及对那非类和拉非类成分的检测领域，具体涉及一种PDE-5抑制剂胶体金免疫层析试纸条及其制备和使用方法。

背景技术

5型磷酸二酯酶(PDE-5)属于环核苷酸水解酶家族，主要存在于阴茎海绵体、平滑肌及血小板中，能特异性地与环鸟苷酸结合，是阴茎中环鸟苷酸代谢失活的主要同工酶。PDE-5抑制剂可选择性地抑制存在于阴茎海绵体的PDE-5的活性，使局部环鸟苷酸浓度维持在较高的水平，促进海绵体平滑肌松弛、血流量增加达到治疗阳痿的效果。目前，已获准上市的PDE-5抑制剂主要包括西地那非、伐地那非和他达拉非。

近年来，世界各国的科研机构和药品检验部门，不断报道在天然保健品或中成药中检出了违法添加的PDE-5抑制剂，其中不仅包括三种已经获准上市的药物，而且还包括它们进行了轻微结构改造的类似物。获准上市的PDE-5抑制剂药品是处方药，会产生不同程度的副作用。但消费者在不知情的情况下服用违法添加的PDE-5抑制剂，主要有以下几个方面的风险：

①PDE-5抑制剂与硝酸酯药物相互作用会导致严重低血压；②PDE-5抑制剂的类似物没有经过临床研究，存在未知危险因素；③违法添加的PDE-5药物剂量往往超过安全使用剂量，对身体健康构成严重威胁。

目前，检测PDE-5抑制剂的方法主要有高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法，核磁共振色谱法等等。但是这些方法设备昂贵、运行费用高、操作过程复杂，不适合在基层部门广泛开展，普通消费者也无法使用。另外，对于新出现的PDE-5抑制剂药物的结构类似物，往往会规避常规方法的检验，产生假阴性的结果。

免疫检测方法具有灵敏度高、特异性强、方便快捷、操作简单、成本低廉，无需借助昂贵的设备等优点，特别是胶体金免疫层析试纸条的出现，更加适合基层部门和普通消费者使用。

目前，市场上已有部分检测PDE-5抑制剂的胶体金免疫层析试纸条(如西地那非)，但大部分是只能同时检测一种成分，给实际应用带来了不便。

发明内容

本发明的目的是针对以上现有技术存在的缺陷，提供一种可同时检测较多种那非类和拉非类成分的胶体金免疫层析试纸条，可用于壮阳类保健品及中成药等产品中那非类和拉非类成分的快速检测和初筛。

为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种PDE-5抑制剂胶体金免疫层析试纸条，该试纸条包括PVC底板、样品垫、金标垫、检测线、控制线、硝基纤维素膜、吸水垫；所述样品垫、金标垫、检测线、控制线、硝基纤维素膜、吸水垫均设置在PVC底板的上方，所述样品垫设置在PVC底板的一端的边缘，金标垫设置在样品垫内侧并与样品垫部分重叠；吸水垫设置在PVC底板的另一端，硝基纤维素膜设置在金标垫与吸水垫之间并分别与两者部分重叠；检测线在硝基纤维素膜上靠近金标垫的一端，控制线喷涂在靠近吸水垫的一端，所述样品垫和金标垫为玻璃纤维膜；金标垫上包被有胶体金标记的那非类通用抗体和拉非类通用抗体混合物；所述检测线包被那非类通用半抗原(NFA)与载体蛋白的偶联物，以及拉非类通用半抗原(LFA)与载体蛋白的偶联物；所述控制线上包被兔抗鼠或羊抗鼠IgG抗体；所述吸水垫为滤纸；所述那非类通用半抗原(NFA)如式Ⅰ所示，所述拉非类通用半抗原(LFA)如式Ⅱ所示。

本发明所述用于检测那非类和拉非类成分的PDE-5抑制剂胶体金免疫层析试纸条的制备方法，包括以下步骤：

1.制备通用半抗原-载体蛋白偶联物：将那非类通用半抗原(NFA)或拉非类通用半抗原(LFA)与牛血清白蛋白(BSA)或卵清白蛋白(OVA)，通过碳二亚胺法、活化酯法、混合酸酐法、重氮化法或戊二醛法等方法进行偶联，制备通用半抗原-BSA偶联物与通用半抗原-OVA偶联物；

2.制备那非类通用抗体和拉非类通用抗体：将通用半抗原-BSA偶联物多次免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞在体外进行融合，制备杂交瘤细胞，将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔收集腹水，或以体外细胞培养的收集上清液的方式制备那非类通用抗体和拉非类通用抗体；

3.制备胶体金：以柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，胶体金溶液中胶体金颗粒直径在20～40nm之间；

4.胶体金标记抗体：在胶体金溶液中加入那非类通用抗体和拉非类通用抗体，其中那非类通用抗体和拉非类通用抗体的比例为1:1，加入上述两种抗体的量为每毫升胶体金溶液中加入1μg～20μg，加入后混匀，通过离心纯化、浓缩，制备成胶体金标记的那非类通用抗体和拉非类通用抗体混合物；