[发明专利]一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料制备方法及应用

权利要求书

1.一种用于软骨损伤修复的细胞-支架复合材料，其特征在于细胞为鱼卵母细胞提取物诱导兔皮肤成纤维细胞产生的重编程细胞，支架为魔芋葡甘聚糖和透明质酸钠通过冷冻干燥法制备的复合支架KGM/HA；制备方法为：

(1)将经过无菌处理的KGM/HA支架置于细胞培养六孔板中；

(2)用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基混悬重编程细胞，并调整其浓度为每毫升1×10⁶个重编程细胞；

(3)将调整好浓度的重编程细胞接种于六孔板中的无菌KGM/HA复合材料上，每孔接种5mL；

(4)将步骤(3)中接种好重编程细胞的六孔培养板置于37℃、5％CO₂、90％湿度条件下培养，每两天更换一次培养液，培养10天；

(5)小心吸净步骤(4)中六孔板中的培养基，加入2mL戊二醛溶液固定细胞；冷冻干燥后喷金，扫描电子显微镜下观察细胞在支架上的形态及生长和黏附情况，扫描电镜结果显示，重编程细胞贴附生长在支架的孔壁及材料表面，细胞相互粘连成片，细胞伪足在材料表面延伸并吸附于材料表面，细胞生长情况良好，且细胞在支架表面大量增殖，细胞呈星形、三角形、多角形及长梭形多种形态，细胞相互连接和重叠，形成层叠结构。

2.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于鱼卵母细胞提取物诱导兔皮肤成纤维细胞产生重编程细胞的方法为：

(1)鱼卵母细胞提取物的制备：选择卵母细胞卵黄充满时鲫鱼，用75％的酒精浸泡15～20分钟，在无菌的条件下取出鱼卵，置入预冷的研钵中，将研钵置于冰上进行研磨，充分研碎后，按体积1:1的比例加入预冷的生理盐水，4℃条件下1000rpm离心10min，然后4℃条件下3000rpm离心10min，取上清，使用0.22微米孔滤器进行过滤，利用考马斯亮蓝法测定制备的鱼卵母细胞提取物的蛋白含量，根据测得的蛋白浓度用预冷的DMEM/F12培养基稀释成10mg/mL，4℃保存备用；

(2)皮肤采集：选择6月龄、健康的兔背部皮肤组织，在75％酒精反复消毒条件下剪取1×1cm²备用；

(3)兔皮肤成纤维细胞的制备：将采集的皮肤组织用生理盐水反复冲洗后置于含有100U/mL氨苄青霉素和100mg/mL硫酸链霉素的PBS溶液中清洗三次，弃脂肪和结缔组织，将组织剪碎成0.5～1mm³大小的组织块，加入含有胶原酶200U/mL、透明质酸酶300U/mL的DMEM培养基，置于4℃条件下过夜；按1:1的比例加入含有0.25％胰酶和0.02％EDTA的PBS消化液，置于37℃条件、180rpm的空气摇床中20min，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基10mL终止反应；1000rpm离心10min后弃上清、收集细胞，用DMEM培养基洗脱2次后，用含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基调整为每毫升2×10⁵个细胞接种，将细胞置于37℃、5％CO₂、90％湿度条件下培养，每2天更换一次培养液；通过鉴定、培养、传代至第四代兔皮肤成纤维细胞，且成纤维细胞达到80％细胞融合、细胞形态正常、轮廓清晰时进行鱼卵母细胞重编程；

(4)兔皮肤成纤维细胞的鱼卵母细胞提取物诱导：待传代至第四代兔皮肤成纤维细胞的细胞贴壁后，加入蛋白浓度为10～20μg/mL的卵母细胞提取液进行诱导72小时；

(5)重编程细胞特征鉴定。

3.根据权利要求1所述的复合材料，其特征在于复合支架KGM/HA的制备方法为：将0.06g HA粉分散于40mL水中，磁力搅拌，加入0.08mL NH₃·H₂O调整pH值，加入1.50g的KGM，同时继续磁力搅拌，直至搅拌自行终止、密封；70℃下水浴熟化，相同条件下脱碱；再将其置于低温冷冻储存箱中，在-20℃条件下冷冻24h后取出，最后在冷冻干燥机中干燥，制得复合支架KGM/HA。