[发明专利]一株分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2及其应用

说明书

一株分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明的分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13099。所述杂交瘤细胞株CGMCC No.13099可以分泌产生对他达拉非具有较好的特异性和较高的灵敏度，对他达拉非的50%抑制浓度IC₅₀为2μg/L，可以用于制备他达拉非的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为中成药和保健食品中他达拉非的检测提供有力的检测方法及手段。

技术领域

本发明涉及一株分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株CIT1F2及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

他达拉非（Tadalafil, Ta）为可逆的选择性磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制剂，用于治疗功能性勃起障碍（ED）。由于其疗效优于枸橼酸西地那非（俗称“伟哥”），于是个别不法厂家将其添加于中药保健品。而他达拉非对心肌梗死、心律失常等心脏疾患有很大的危害,故随意服用后果严重。由于保健品中添加枸橼酸西地那非的报道较多，已引起人们的注意，而添加他达拉非又具有一定的隐蔽性，因此有必要建立快速、灵敏的检测方法用以鉴定此类保健品，为药监部门认定、查处提供参考依据。

目前他达拉非检测多采用理化方法如紫外光谱法、薄层色谱法和高效液相色谱法等，紫外光谱法和薄层色谱法因干扰难以排除，方法受到限制。仪器检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。

发明内容

本发明的目的在于提供一株分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2及其应用，为间接竞争 ELISA 试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。

本发明的技术方案，一株分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号CGMCC No.13099，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。

抗他达拉非特异性单克隆抗体，其由所述保藏编号CGMCC No.13099杂交瘤细胞株CIT1F2分泌产生。

所述抗他达拉非特异性单克隆抗体的应用，用于食品中他达拉非残留检测中的应用。

本发明提供的细胞株CIT1F2的制备基本步骤为：

（1）免疫原的制备与鉴定：他达拉非半抗原通过碳化二亚胺法（EDC法）与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）小鼠的免疫：将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株CIT1F2；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC₅₀值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。