[发明专利]一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法及其试剂盒

说明书

本发明提供了一种循环肿瘤细胞的分选和/或富集的方法，本发明提供的方法利用生物素标记的抗Her2单克隆抗体、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体和生物素标记的抗Trop2单克隆抗体与亲和素包被的磁珠之间极高且稳定的亲和力，提供了一种免疫磁珠方法来分选和/或富集循环肿瘤细胞。本发明还提供了一种用于肿瘤细胞分选和/或富集的试剂盒。本发明的方法可以灵敏地捕获肿瘤细胞，适用于肿瘤细胞的广谱性筛选，并且克服了普通磁珠筛选的位阻效应缺陷，达到高效捕获肿瘤细胞的效果。

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法，本发明还涉及一种用于循环肿瘤细胞分选和/或富集的试剂盒。

背景技术

循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)是脱落进入血液循环的肿瘤细胞，大量实验已经证实CTC检测有助于肿瘤复发转移监控、判断患者预后、指导术后辅助治疗等。但是CTC在外周血中的数量极少，通常在约1亿个白细胞和500亿个红细胞中仅有数个肿瘤细胞。因此，为了提高循环肿瘤细胞的检出率，通常需要在检测前进行循环肿瘤细胞的富集。循环肿瘤细胞的富集可以通过使用肿瘤细胞的特异性标志物来分离(免疫分离)或利用细胞形态特征的差异(如细胞体积和密度等)来实现。

常用的细胞富集技术主要有免疫磁珠分选、密度梯度离心和细胞过滤等。免疫磁珠分选是以抗原抗体结合为基础的循环肿瘤细胞分离方法，是目前最常用的方法(如CN201110005376.8，一种从组织中分离富集靶细胞的方法；循环肿瘤细胞的检测及其在乳腺癌患者中的临床应用，马德亮等，临床肿瘤学杂志，2010年11月第15卷第11期；循环肿瘤细胞的检测，李帅等，医学综述，2010年3月第16卷第6期)等，其基本原理是利用肿瘤细胞和正常血液细胞表达的不同表面抗原标记，设计不同的抗体与之结合，利用抗原抗体结合的高度特异性和灵敏性，达到区别和富集循环肿瘤细胞的目的(多是将抗体和磁珠结合，在磁场中达到分离的目的)。抗体免疫磁珠是将特异性单抗与磁珠相结合，细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，没有相应表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞分离。

但是，当前抗体与磁珠的直接偶联通常采用NHS-活性酯法，即活化的羧基化磁珠与抗体的伯氨基基团反应。其中，氨基的电负性越强，偶联效率越高。然而带电氨基酸往往在抗体结构稳定和在抗体与抗原的结合过程中扮演重要的角色。这些关键氨基酸与磁珠的交联会严重影响抗体结构的稳定性和抗体的活性。另外，在磁珠-抗体直接偶联的方法中，磁珠与抗体上的氨基酸直接交联，由于磁珠的空间位阻会影响抗体的结构，容易造成抗体的疏水区外露，容易造成抗体的聚焦而失去活性，从而影响其产品的稳定性。而且，由于外周血中循环肿瘤细胞(CTC)数量稀少，且具有异质性和易聚集成团等特点。该方法在灵敏性、特异性和可重复性等方面也存在诸多问题。

申请号为CN201410497998.0的中国专利申请公开了一种抗体免疫磁珠方法，它公开了联用三种抗HLA-G、EpCAM和CK8/18的单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中的应用。但该方法采用不具有选择性的醛基偶联方法。醛基既可以和氨基反应，也可以和羧基反应。该方法经常用在蛋白和蛋白之间的偶联反应中。蛋白和蛋白之间的多聚交联可以通过超高速离心/分子筛和超滤等方法去除。由于该方法的反应过程不可控，且抗体自身的交联无法有效去除，抗体和磁珠偶联一般不会采用这种方法。其反应过程的不可控会造成抗体和磁珠的偶联效率低下，且批与批之间的差异会较大。因此，在实际的生产应用中，该方法很难生产出稳定的产品。另外，抗体和磁珠的直接偶联会导致磁珠对抗体有较强的位阻效应，交联后对抗体的活性影响较大，容易导致肿瘤细胞捕获效率受影响。其优化的三种抗体联用比例也不具有重复性。

基于此，当前对可以用于实际生产应用的重复性高、效率高的循环肿瘤细胞富集方法存在需求。

发明内容