[发明专利]一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种循环肿瘤细胞分选和/或富集的方法，所述方法包括以下步骤：

1)使用生物素标记抗Her2(人表皮生长因子受体2)单克隆抗体、抗EpCAM(上皮细胞粘附分子)单克隆抗体和抗Trop2(人滋养层细胞表面抗原2)单克隆抗体，并将其混合；

其中，三种单克隆抗体混合后的质量百分比范围为：

生物素标记的抗Her2单克隆抗体35％；

生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体20％；

生物素标记的抗Trop2单克隆抗体45％；

2)将步骤1)得到的混合物加入到待分选的细胞液中；

其中，所述混合物与细胞液的体积比为1～5:1000；

生物素标记的抗Her2单克隆抗体、生物素标记的抗EpCAM单克隆抗体、生物素标记的抗Trop2单克隆抗体的混合物在细胞液中使用的终浓度分别为500μg/ml；

3)加入链霉亲和素偶联的磁珠，在4℃孵育20分钟，收集磁珠，即得；

其中，所述待分选的细胞液与磁珠的体积比是1000:10～30；

其中，所述肿瘤选自乳腺癌、非小细胞肺癌和/或结肠癌。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤2)中，所述混合物与细胞液的体积比为2～3:1000。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤3)中，所述待分选的细胞液与磁珠的体积比为1000:20。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述三种生物素标记的单克隆抗体分别通过包括以下步骤的方法制备：

a.使用超滤柱纯化抗体溶液；

b.加入NHS-PEG4-Biotin溶液，在室温下反应0.5～4h；

其中，NHS-PEG4-Biotin与抗体的摩尔浓度比例为10-50:1；

c.分离纯化以去除游离生物素，得到生物素标记的单克隆抗体溶液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤b.中，加入NHS-PEG4-Biotin溶液，在室温下反应0.5-3h。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤b.中，加入NHS-PEG4-Biotin溶液，在室温下反应1h。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤c.中，所述分离纯化使用葡聚糖凝胶进行。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤a通过包括以下步骤的方法完成：

①制备标记反应溶液；

所述标记反应溶液包括以下组分：

NaCl：10-300mmol/L；KCl：1-5mmol/L；Na₂HPO₄：5-50mmol/L；KH₂PO₄：1-5mmol/L；

②于超滤柱中加入标记反应溶液，然后加入单克隆抗体，混匀，然后离心，弃滤液；

其中，所述标记溶液与所述单克隆抗体的体积质量比为1:1-50(μl/μg)；

③混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置后，将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，离心收集滤液，取PBS于超滤柱中混匀，静置；倒置超滤柱，离心收集滤液。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤①中，所述标记反应溶液包括以下组分：

NaCl：137mmol/L；KCl：2.7mmol/L；Na₂HPO₄：10mmol/L；KH₂PO₄：2mmol/L。

10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤②中，重复步骤2～3次。