[发明专利]一种荧光定量检测INHB的免疫层析试剂条及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫诊断技术领域，具体涉及一种荧光定量检测抑制素B（INHB）的免疫层析试纸条及其制备方法。

背景技术

抑制素B(inhibin B, INH-B)是睾丸来源的糖蛋白激素，成年男性体内血清抑制素B水平与FSH呈显著负相关，对FSH起负反馈作用。男性出生后不久，血清抑制素B水平逐渐上升，抑制素B与FSH之间一直维持负相关关系。20~30岁时，抑制素B水平到达高峰，此后抑制素B水平随年龄增加逐渐降低。

生精功能低下与生精阻滞男性血清抑制素B水平显著低于正常生精功能男性，唯支持细胞综合征（SCO）男性血清抑制素B水平极低，SCO的发生与血清抑制素B的水平显著相关，血清抑制素B的水平还与睾丸体积、精子总数显著相关。抑制素B水平反映了整个睾丸组织的功能，是输精管道的直接产物，成年男性血清中维持可检测的抑制素B水平需要生精细胞的存在，因此抑制素B被认为是男性精子发生的血清标志物。血清抑制素B测定可用于评价男性不育病人的生精功能，儿童隐睾、性早熟的诊断，对非阻塞性无精子症病人睾丸精子抽吸的预测，监测放、化疗对男性生精功能的损伤等。

目前临床上INHB的检测方法有酶联免疫法（ELISA）、电化学发光法和化学发光法，这些方法都有各自的优点和不足。ELISA法检测步骤多、耗时长，操作过程的影响因素较多，易造成假阳性和假阴性结果。因此目前逐步被化学发光法替代，但这类方法为全封闭系统，价格昂贵，需要专门培训仪器使用人员，维修及检测成本高，并且不适合单人份和小批量检测用，目前不利于INHB检测在国内的广泛开展。

鉴于目前尚无快速、准确的定量检测INHB的方法，本发明的目的是提供一种可用于快速定量检测INHB的免疫层析试纸条，用于评估和监测男性生精功能，所述试剂具有操作简单、方便快捷、经济、准确定量等优点，更适用于在各医疗机构广泛开展。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中存在的不足，提供一种操作简单、方便快捷、经济、测定准确的INHB检测试纸条。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种荧光定量检测INHB的免疫层析试纸条，由样品垫、标记垫、包被膜、吸水纸顺次搭接在PVC底板上构成，所述标记垫上喷涂有荧光微球标记的INHB单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素；所述包被膜包含检测线和质控线，所述检测线包被有与所述荧光微球标记的INHB单克隆抗体处于不同表位的另一种INHB单克隆抗体。所述质控线包被有特异性识别亲和素的兔抗亲和素抗体。

优选地，所述荧光微球标记的INHB单克隆抗体的浓度为0.1~1.0 mg/mL，稀释比例为5%~20%。所述荧光微球标记的亲和素的浓度为0.1~1.0 mg/mL，稀释比例为0.5%~5%。所述含荧光微球标记的INHB单克隆抗体和荧光微球标记的亲和素的标记垫处理液的喷量为3~6 μL/cm。

优选地，所述荧光微球的粒径为100~500 nm。所述荧光微球的激发波长为310~550 nm，发射波长为340~ 620 nm。

优选地，所述包被膜检测线上包被的INHB单克隆抗体的浓度为0.5~2 mg/mL，喷量0.1~0.2μL/mm。所述质控线上包被的兔抗亲和素抗体的浓度为0.5~2 mg/mL，喷量0.1~0.2μL/mm。

本发明还提供一种荧光定量检测INHB的免疫层析试纸条的方法，包括以下步骤：

（1）荧光微球标记蛋白的制备

取一定量的荧光微球，10000~15000 rpm离心5~15分钟，沉淀物用10~100 mM pH6.0~7.0磷酸盐缓冲液调节浓度为0.1%~1%，并超声分散；加入终浓度为0.1~5 mg/mL的碳二亚胺（EDC），混匀，再加入终浓度为0.1~5 mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），混匀；室温孵育20~40分钟后10000~15000 rpm离心5~15分钟，沉淀物用10~100 mM pH6.0~7.0磷酸盐缓冲液溶解。将复溶后的荧光微球超声分散，按照0.1~1.0 mg/mL荧光微球的比例分别加入INHB单克隆抗体和亲和素，混匀后室温旋转混合反应1.5~3小时，10000~15000 rpm离心5~15分钟，沉淀物用含10~40 mM乙醇胺和0.05%-1%酪蛋白的Tris-HCl（10~40mM，pH 7.0-8.0）复溶，超声分散后旋转混合反应0.5~1小时。10000~15000 rpm离心5~15分钟，沉淀用微球保存液复溶，2~8℃保存。

（2）样品垫的预处理