[发明专利]一种单克隆抗体

说明书

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种单克隆抗体。该单克隆抗体3G3结合FVII依赖钙离子的存在。采用Roche公司的抗体亚型鉴定试纸条对3G3抗体亚型进行鉴定，结果证实3G3单克隆抗体亚型为IgG1，Kappa型。应用单克隆抗体3G3偶联的Sepharose 4B可成功纯化重组人凝血因子VII，目的蛋白分子量显示为60kDa，与预期一致。测定3G3单克隆抗体的亲和常数。结果表明本发明提供的单克隆抗体3G3与凝血因子FVII的亲和力较好。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种单克隆抗体。

背景技术

凝血级联反应是止血过程的中心环节。当凝血途径存在缺陷时，出血时间(bleeding time)延长，出血量增加。凝血因子是参与凝血过程的蛋白质分子，生理情况下，多数凝血因子以无活性的酶原形式存在，当组织损伤时，这些凝血因子相继被酶解激活转化为有活性的蛋白酶，最终凝血酶原转化为凝血酶，使可溶性的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白团块。

凝血因子VII属维生素K依赖的凝血因子,由肝脏合成，其主要作用是与组织因子形成复合物，从而启动外源性凝血途径。

血友病A和血友病B为X染色体连锁的遗传性出血性疾病，分别以凝血因子VIII(FVIII)和IX(FIX)缺乏为特征。这类病人面临着创伤后大量出血和自发性出血的危险。世界卫生组织统计显示血友病A的发病率约为1/5000新生男婴，血友病B的发病率约1/20000新生男婴。血友病的传统治疗方式是凝血因子补充治疗，即静脉输注血浆来源或基因重组的FVIII或FIX，纠正凝血因子异常，降低出血倾向。但是，约有25％的重症血友病A病人产生FVIII抑制物(抗体)，约有4％的重症血友病B病人产生FIX抑制物，使凝血因子补充治疗疗效降低甚至无效。许多患者死于无法控制的出血；因出血而导致的重度关节损害的问题仍然十分严重；对有抑制物的患者进行手术时如何止血，尤其是一个特殊的难题。FVIIa可通过旁路途径绕过依赖于FVIII和FIX的凝血途径，激活FX产生FXa,促进大量的凝血酶原转化成凝血酶，形成“凝血酶爆发”。重组FVIIa用于治疗存在有FVIII或FIX抑制物的先天性血友病患者的自发性或手术性出血，先天性凝血因子VII缺乏患者。

人凝血因子VII抗体可用于重组凝血因子VII的亲和层析纯化及检测。然而，一般抗体介导的亲和层析需采用酸洗脱，由此产生的影响之一是改变了纯化工艺中的样品缓冲液，使纯化工艺复杂化；此外，低pH极有可能影响样品的活性。而钙离子依赖的抗体可在原有样品缓冲液中加入钙离子螯合剂EDTA使抗原抗体分离，避免了酸洗脱带来的上述不利影响。因此，迫切需要自主开发钙离子依赖的抗人凝血因子VII单克隆抗体。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种单克隆抗体。该单克隆抗体可与凝血因子VII特异性结合，具有较好的亲和力。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种钙离子依赖的特异性结合凝血因子VII的单克隆抗体，由保藏编号为CCTCC No：C2012158的杂交瘤细胞株产生。

本发明所述单克隆抗体的制备方法如下：用商品化的重组人活化凝血因子VII(NovoSeven)与等体积的弗氏完全佐剂充分混合乳化后于Balb/c小鼠背部皮下多点注射，4周后取NovoSeven与等体积弗氏不完全佐剂混合乳化后小鼠背部皮下多点注射加强免疫一次，8周后取NovoSeven小鼠尾静脉注射免疫冲击，4天后取出脾脏，分离出脾脏细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0以10:1的细胞数比例混合，离心后于细胞沉淀中加入融合剂PEG1500进行融合，转入96孔板中用含1％HAT的选择性培养基筛选，以后每隔2天对半换液，10-14天取细胞培养上清进行ELISA检测筛选。